[發明專利]一種用于間接血凝（IHA）法檢測日本血吸蟲抗體的特異抗原制備方法

在審

• 申請號: 201910797781.4
• 申請日: 2019-08-27
• 公開（公告）號: CN110609138A
• 公開（公告）日: 2019-12-24
• 發明（設計）人: 汪天平;王恩木;章樂生;張世清;呼明闖
• 申請（專利權）人: 安徽省血吸蟲病防治研究所
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 11390 北京和信華成知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 胡劍輝

1.一種用于間接血凝(IHA)法檢測日本血吸蟲抗體的特異抗原制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一：制備血吸蟲特異抗原：

步驟1、制備日本血吸蟲可溶性成蟲抗原；

步驟2、制備日本血吸蟲可溶性尾蚴抗原；

步驟3、制備日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原；

步驟4、將制備的日本血吸蟲可溶性成蟲抗原，加入10mmol/L過碘酸鈉室溫反應30min，再加入50mmol/L硼氫化鈉室溫30min終止反應；將處理后的日本血吸蟲可溶性成蟲抗原溶液置pH7.2 PBS中透析并于4℃過夜，超濾濃縮后配制1mg/ml溶液；同法將日本血吸蟲尾蚴抗原和蟲卵抗原，經過碘酸鈉和硼氫化鈉處理，經透析和超濾濃縮后制備成1mg/ml溶液；過碘酸鈉氧化法可使糖分子的羥基變成醛基或酮基，使蛋白所攜帶的糖基分子被破壞；

步驟5、將經過碘酸鈉處理過的日本血吸蟲可溶性成蟲抗原、日本血吸蟲可溶性尾蚴抗原和日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原按體積比1:0.5:2比例混合，即為特異抗原；

步驟二：特異抗原制備間接血凝試劑：

步驟1、醛化紅細胞制備；

步驟2、鞣化紅細胞制備；

步驟3、致敏紅細胞懸液的制備；

步驟4、凍干致敏紅細胞制備；

在致敏紅細胞懸液中加入10％濃度的蔗糖和2％濃度的經56℃滅活30min后的兔血清；搖勻后分裝于2mL的安瓿瓶內，每支含量0.5mL；將分裝后的致敏紅細胞放入冷凍干燥機內進行抽干，并用封口機進行封口，凍干致敏紅細胞外觀為褐色或淡紅色疏松體。

2.根據權利要求1所述的一種用于間接血凝(IHA)法檢測日本血吸蟲抗體的特異抗原制備方法，其特征在于：所述步驟一中步驟1、制備日本血吸蟲可溶性成蟲抗原方法為：取日本血吸蟲成蟲凍干品，按1％濃度加入pH5.6的50mmol/L醋酸鈉緩沖液，在-20℃和37℃之間反復凍融3次后，超聲10min，置冰箱中冷藏放置過夜，于4℃10000g離心30min，吸取上清，經濾紙過濾后再次4℃10000g離心30min離心，吸取上清即為日本血吸蟲可溶性成蟲抗原，蛋白測定后以醋酸鈉緩沖液配制成1mg/ml終濃度備用。

3.根據權利要求1所述的一種用于日本血吸蟲抗體檢測的特異抗原制備間接血凝試劑的方法，其特征在于：所述步驟一中步驟2、制備日本血吸蟲可溶性尾蚴抗原方法為：取日本血吸蟲尾蚴凍干品，按1％濃度加入pH5.6的50mmol/L醋酸鈉緩沖液，在-20℃和37℃之間反復凍融3次后，超聲10min，置冰箱中冷藏放置過夜，于4℃10000g離心30min，吸取上清即為日本血吸蟲可溶性尾蚴抗原，蛋白測定后以醋酸鈉緩沖液配制成1mg/ml終濃度備用。

4.根據權利要求1所述的一種用于日本血吸蟲抗體檢測的特異抗原制備間接血凝試劑的方法，其特征在于：所述步驟一中步驟3、制備日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原方法為：取日本血吸蟲蟲卵凍干品，按1％濃度加入pH5.6的50mmol/L醋酸鈉緩沖液，在-20℃和37℃之間反復凍融3次后，超聲10min，置冰箱中冷藏放置過夜，于4℃10000g離心30min，吸取上清即為日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原，蛋白測定后以醋酸鈉緩沖液配制成1mg/ml終濃度備用。

5.根據權利要求1所述的一種用于日本血吸蟲抗體檢測的特異抗原制備間接血凝試劑的方法，其特征在于：所述步驟二中步驟1、醛化紅細胞制備方法為：取“O”型人紅細胞，用生理鹽水洗滌3次，移入刻度離心管，1 200g離心10min，記錄壓積紅細胞體積，取壓積紅細胞，每1mL加pH 7.2PBS 25mL混勻，再緩慢滴加2.5％戊二醛2mL，邊滴邊搖，滴至最后一滴，室溫搖蕩1h，用PBS洗滌3次，再用蒸餾水洗滌2次，最后用0.01％硫柳汞生理鹽水配成10％醛化紅細胞懸液，置2℃～8℃備用。