[發明專利]一種產煙酸的超級重組恥垢分枝桿菌及其構建方法

有效

• 申請號: 201910796809.2
• 申請日: 2019-08-27
• 公開（公告）號: CN110551748B
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 詹玉心;吳澤承;周亞鳳;王緒德
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/90;C12N15/31;C12N1/21;C12R1/34
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 朱繼超

本發明提供了一種產煙酸的超級重組恥垢分枝桿菌的構建方法，包括步驟：1）構建質粒pMHS?NrtR_ms；2）構建質粒pHAGE?NrtR_ms；3）制備重組TM4噬菌體；4）構建nrtR_ms基因缺失的恥垢分枝桿菌mc²100；5）nudC基因的擴增及構建質粒pMV361?NudC_ms；6）構建nrtR_ms基因敲除且nudC基因過表達的超級重組恥垢分枝桿菌。本發明通過構建nrtR基因敲除且nudC基因過表達制得超級重組恥垢分枝桿菌，通過本發明制備得到的工程菌可以一步直接獲得煙酸，而不依賴于添加3?氰基吡啶，不僅避免了現有在煙酸化學合成過程中的各種缺點，而且生產條件簡單，無污染，簡便易行，易放大，成本低，適合于大規模工業化生產應用，有很大的推廣應用的價值。

技術領域

本發明涉及煙酸的生產技術領域，具體涉及一種產煙酸的超級重組恥垢分枝桿菌及其構建方法。

背景技術

煙酸即3-吡啶甲酸，也稱作為維生素B3，屬于維生素B族，是一種水溶性維生素，屬于維生素B族，是人體必需的13種維生素之一。煙酸是機體組織中重要的遞氫體和抗糙皮病的因子，有維持皮膚和神經健康，促進消化的作用。若其缺乏時，可產生糙皮病，表現為皮炎、舌炎、口咽、腹瀉及煩躁、失眠感覺異常等癥狀。與煙酰胺統稱維生素PP，用于抗糙皮病，亦可用作血擴張藥。作為醫藥中間體，用于異煙肼、煙酰胺、尼可剎及煙酸肌醇酯等的生產。現煙酸也用于糧食制品，肉品添加劑和飼料添加劑以預防糙皮病。特別是飼料中添加煙酸后可提高畜禽的抗病能力，加快生長速度，提高飼料的利用率，可大量節省飼料，降低飼養成本。美國曾喂養用添加煙酸的飼料的喂養奶牛，與對照組相比，產奶量可提高15％-20％。另外煙酸還可作為形成活性污泥的生化激素、空氣和廢氣的除臭劑。煙酸在染料工業、感光材料工業、染發助劑、洗滌劑等方面也有一定的應用。

煙酸的生產目前工業上應用的主要為化學法，合成方法主要有液相法（高錳酸鉀氧化法和硝酸氧化法）和氣相法（臭氧氧化法、氨氧化法和空氣氧化法），所用原料主要為3-甲基吡啶、2-甲基-5-乙基吡啶、3-氰基吡啶以及哇琳等。最常用的方法是以3-甲基吡啶為原料用空氣氧化法合成煙酸。將3-甲基吡啶、空氣和氨氣按比例通入流化床反應器中，在290～360℃、V₂O₅催化下反應生成煙腈；再于氫氧化鈉水溶液中、160℃下高壓水解生成煙酸鈉，最后用鹽酸酸化得煙酸。在這個合成過程中需要經過煙腈這一部中間產物，煙腈通過化學反應生成水解為煙酸需要高溫高壓、強酸強堿的條件，對設備具有一定的要求而且也會腐蝕設備，且對環境也不友好。清華紫光公司的專利CN114288A報道了用3-甲基吡啶一步催化生成煙酸，其過程為將3-甲基吡啶與硫酸反應生成甲基吡啶硫酸鹽，然后在氧化劑硝酸的作用下氧化生成煙酸硫酸鹽，煙酸硫酸鹽加入堿溶液中可和制得煙酸，原料收率為90％左右。此過程中需要硫酸、硝酸、堿溶液等強酸強堿物質，污染嚴重。

在煙酸化學合成過程中，必須具備特定的高溫高壓環境或者采用強酸、強堿或化學催化劑處理，反應選擇性不高，副產物多，產品的收率不高，環境污染大。相對而言，生物法制備煙酸具有底物選擇性高、催化效率高、反應條件溫和、環境污染小等特點。此外，生物法制備易放大，成本低，適合于大規模工業化生產應用。目前有報道用微生物枯草芽孢桿菌、玫瑰色紅球菌、諾卡氏菌、茄病鐮刀菌以及惡臭假單胞菌發酵來生物催化3-氰基吡啶制備煙酸。但是，生物催化法制備煙酸主要是依賴于微生物發酵產腈水解酶，通過此酶來催化3-氰基吡啶轉化為煙酸，仍然需要添加原料3-氰基吡啶。

發明內容

本發明的目的是解決現有技術的不足，提供了一種產煙酸的超級重組恥垢分枝桿菌的構建方法。

為了實現上述目的，本發明采用以下的技術方案：

一種產煙酸的超級重組恥垢分枝桿菌的構建方法，包括以下步驟：

1）構建質粒pMHS-NrtR_ms：