[發明專利]一種產煙酸的超級重組恥垢分枝桿菌及其構建方法

有效

• 申請號: 201910796809.2
• 申請日: 2019-08-27
• 公開（公告）號: CN110551748B
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 詹玉心;吳澤承;周亞鳳;王緒德
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/90;C12N15/31;C12N1/21;C12R1/34
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 朱繼超

1.一種產煙酸的超級重組恥垢分枝桿菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）構建質粒pMHS-NrtR_ms：

1-1）以恥垢分枝桿菌mc²155基因組DNA為模板、SEQ?ID?No.1~4所示的引物對進行PCR擴增，電泳分離后經Van91I限制性內切酶酶切備用；

1-2）將含有pMHS質粒的大腸桿菌DH5α菌株擴大培養，然后收集菌體，抽提質粒，質粒經Van91I限制性內切酶酶切后電泳分離，回收1600?bp區間和3600?bp區間的DNA片段；

1-3）將步驟1-1與1-2所獲得的DNA片段經T4?DNA連接酶16oC反應過夜，連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞擴大培養，抽提質粒后獲得質粒pMHS-NrtR_ms；

2）構建質粒pHAGE-NrtR_ms：

2-1）分別擴大培養含有質粒pHAGE和質粒pMHS-NrtR_ms的大腸桿菌DH5α菌株，抽提質粒，兩個質粒經PacI限制性內切酶線性化后再用T4?DNA連接酶16oC反應過夜，連接產物使用包裝試劑盒包裝并轉化至大腸桿菌HB101感受態細胞擴大培養，抽提質粒后獲得質粒pHAGE-NrtR_ms；

3）制備重組TM4噬菌體：

3-1）擴大培養恥垢分枝桿菌mc²155，振蕩培養至對數生長期，離心收集菌體，用預冷的10%無菌甘油洗滌菌體，然后加入預冷的10%的甘油重懸菌體，-80oC凍存備用；

3-2）將質粒pHAGE-NrtR_ms轉入恥垢分枝桿菌mc²155電轉感受態細胞中，冰上孵育10min，然后電擊轉化，轉化后加入7H9液體培養基，37oC培養箱孵育過夜，將37oC放置后的菌液加到含有top?agar的EP管中混勻并傾倒平鋪在7H10固體平板上，平板置30oC培養箱培養2-3天，獲得重組TM4噬菌體；

4）構建nrtR_ms基因缺失的恥垢分枝桿菌mc²100：

7H9液體培養基培養恥垢分枝桿菌mc²155至對數生長期，離心收集菌體，用MP?buffer洗滌離心獲得菌體，然后用MP?buffer重懸菌體，將重懸的恥垢分枝桿菌mc²155與滴度為10¹⁰PFU的重組TM4噬菌體以1:1體積混合后培養箱孵育，然后離心收集菌體棄上清后用7H9液體培養基重懸，放置培養箱孵育過夜，再次離心收集菌體棄上清，菌體涂布7H10固體平板培養，獲得分泌煙酸的突變恥垢分枝桿菌mc²100；

5）nudC基因的擴增及構建質粒pMV361-NudC_ms：

5-1）nudc基因的擴增：以恥垢分枝桿菌mc²155基因組DNA為模板，使用SEQ?ID?No.9~10所示的引物對PCR擴增nudC基因ORF序列，PCR產物經電泳分離回收后使用EcoRⅠ和HindⅢ限制性內切酶酶切，回收酶切后的DNA備用；

5-2）酶切：LB培養含pMV361質粒的大腸桿菌DH5α菌株，抽提質粒后使用EcoRⅠ和HindⅢ限制性內切酶酶切，然后進行電泳分離，回收線性化的質粒；

5-3）連接：酶切回收的DNA片段和經同樣酶切回收的線性化質粒pMV361經T4?DNA連接酶16℃反應過夜，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞并涂布LB固體平板，平板放置37℃恒溫培養箱培養過夜，獲得質粒pMV361-NudC_ms，所述LB固體平板含100μg/mL硫酸卡那霉素；

6）構建nrtR_ms基因敲除且nudC基因過表達的超級重組恥垢分枝桿菌：

6-1）制備突變恥垢分枝桿菌mc²100感受態細胞：7H9液體培養基培養步驟4獲得的突變恥垢分枝桿菌mc²100至對數生長期，離心收集菌體，將菌體用預冷的10%無菌甘油至少洗滌兩次，最后加入適量預冷的10%的甘油，吹勻菌體后，分裝置-80℃凍存備用；

6-2）轉化突變恥垢分枝桿菌mc²100：將質粒pMV361-NudC_ms轉入突變恥垢分枝桿菌mc²100電轉感受態細胞中，冰上孵育10?min，然后電擊轉化，然后加入7H9液體培養基，37℃培養箱孵育過夜，然后取適量培養液涂布7H10固體平板，平板置37℃培養箱培養3～5天，獲得產煙酸的超級重組恥垢分枝桿菌，所述7H10固體平板含50μg/mL硫酸卡那霉素。