[發(fā)明專(zhuān)利]一種人源化抗Grb2單克隆抗體、及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910796374.1
• 申請(qǐng)日: 2019-08-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110563841A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-12-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊瀾;舒雄
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 楊瀾
• 主分類(lèi)號(hào): C07K16/18
• 分類(lèi)號(hào): C07K16/18;C12N15/13;C12N15/85;C12N5/10;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 11212 北京輕創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 馮瑛琪

1.一種人源化抗Grb2單克隆抗體，其特征在于，包括輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)和重鏈互補(bǔ)決定區(qū)，所述輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示，所述重鏈互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示。

2.一種人源化抗Grb2單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：提取鼠雜交瘤細(xì)胞LC-5A1的總RNA；

步驟2：以步驟1提取的總RNA為模板，合成鼠雜交瘤細(xì)胞cDNA的第一條鏈：

步驟3：以步驟2得到的cDNA為模板，采用輕鏈上游引物PVL5和輕鏈下游引物PVL3，擴(kuò)增輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)；采用重鏈上游引物PVH5和重鏈下游引物PVH3，擴(kuò)增重輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)；

步驟4：分離、回收、純化、轉(zhuǎn)染步驟3得到的目的片段，以Pst II和BstE II進(jìn)行雙酶切，并定向克隆入克隆載體pRGWH的相應(yīng)位點(diǎn)，篩選出陽(yáng)性重組克隆，進(jìn)行核苷酸序列分析，構(gòu)建表達(dá)抗Grb2人源化單克隆抗體的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體在pSRNC-Cκ-Grb2或pSRDC-Cγ1-Grb2轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢CHO細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，即得到所述人源化抗Grb2單克隆抗體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人源化抗Grb2單克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟1中，所述提取鼠雜交瘤細(xì)胞LC-5A1的總RNA的方法為：收集1×10⁷鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，10,000rpm離心1min，棄上清，加入1mL的Trizol充分溶解細(xì)胞，室溫靜置3min-5min后加入0.2mL氯仿，顛倒混勻；4℃，12,000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至清潔的1.5mL離心管中，加入0.5mL異丙醇，顛倒混勻；室溫靜置20min；4℃，12,000rpm離心10min，棄上清；75％體積乙醇洗滌2次，空氣干燥后，加入50μL的ddH₂O溶解沉淀物，即得。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人源化抗Grb2單克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟2中，所述合成鼠雜交瘤細(xì)胞cDNA的第一條鏈的反應(yīng)體系為：20μL總反應(yīng)體系中，包括4μL的5×緩沖液、10mM的DDT、10g步驟1提取的總RNA、終濃度為0.5mM的dNTP、終濃度為10μg/mL的Oligo(dT)₁₅、40U的RNAsin和200U的MMLV-反轉(zhuǎn)錄酶，均勻混合，37℃水浴1h，100℃金屬浴滅活。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人源化抗Grb2單克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟3中，所述輕鏈上游引物PVL5的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述輕鏈下游引物PVL3的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述重鏈上游引物PVH5的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述重鏈下游引物PVH3的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述擴(kuò)增輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)的方法為：100μL總反應(yīng)體系中，包括10μL的10×緩沖液、2μL濃度為10mM的dNTP、20μL的步驟2得到的cDNA、50pmol的輕鏈上游引物PVL5和50pmol的輕鏈下游引物PVL3，混勻后表面覆蓋石蠟油，95℃水浴5min后，透過(guò)石蠟油加入2U的Taq和Pfu DNA聚合酶，按下述循環(huán)執(zhí)行PCR擴(kuò)增程序：94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，共30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72℃，10min；所述擴(kuò)增重鏈互補(bǔ)決定區(qū)的方法為：100μL總反應(yīng)體系中，包括10μL的10×緩沖液、2μL的10mM的dNTP、20μL的步驟2得到的cDNA、50pmol的重鏈上游引物PVH5和50pmol的重鏈下游引物PVH3，混勻后表面覆蓋石蠟油，95℃水浴5min后，透過(guò)石蠟油加入2U的Taq和Pfu DNA聚合酶，按下述循環(huán)執(zhí)行PCR擴(kuò)增程序：94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，共30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72℃，10min。

6.一種人源化抗Grb2抗體，其特征在于，包括輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)和重鏈互補(bǔ)決定區(qū)，所述輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述重鏈互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。