[發(fā)明專利]一種新型的測定生物樣品中醛酮化合物的衍生化方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910795903.6
• 申請日: 2019-08-27
• 公開（公告）號: CN110551143A
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李舒?zhèn)?/a>
• 申請（專利權(quán)）人: 南京譜利健生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C07D495/04
• 分類號: C07D495/04;G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 32206 南京眾聯(lián)專利代理有限公司
• 代理人: 李雪萍

本發(fā)明公開了一種新型的衍生化試劑和采用該試劑測定生物樣品中醛酮化合物的衍生化方法。衍生化試劑命名為CILAT（Cleavable Isobaric Labeled Affnity Tag），可以從代謝物環(huán)境中選擇性標(biāo)記醛酮化合物。這個衍生化試劑由三部分組成：1）一個能夠與羰基進(jìn)行特異性反應(yīng)形成共價鍵的氨氧基官能團(tuán)；2）一個能夠被光裂解的生物素基團(tuán)用于標(biāo)記后的醛酮化合物的親和富集；3）一個含有穩(wěn)定同位素標(biāo)記的同量異位標(biāo)簽（Isobaric Tag）用于醛酮化合物的定量分析。檢測方法包括：衍生化試劑分別和不同待測樣品中的醛酮化合物反應(yīng)后，混合在一起，然后利用生物素和鏈霉親和素蛋白之間的強(qiáng)作用力富集CILAT標(biāo)記后的分子，最后用紫外光把生物素部分切斷，產(chǎn)生的剩余分子可以用高分辨質(zhì)譜LC?MS/MS進(jìn)行分析。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及化學(xué)小分子檢測試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種新型的測定生物樣品中醛酮化合物的衍生化方法。

背景技術(shù)

生物小分子代謝物的定量研究具有很大的潛力，可以發(fā)現(xiàn)酶的功能，揭示以前未知的途徑，以及發(fā)現(xiàn)新的疾病標(biāo)志物。在數(shù)百種含有廣泛的結(jié)構(gòu)和多種功能的代謝物中，含有羰基(carbonyl group)的醛類和酮類化合物(醛酮化合物)通常與生物個體的氧化應(yīng)激有關(guān)。因為氧化應(yīng)激在眾多人類疾病中(例如：糖尿病，癲癇，自閉癥，癌癥)起著重要作用，定量測量醛酮類化合物能夠促進(jìn)疾病機(jī)理的研究以及全新的治療方法的開發(fā)。

測定生物樣品中的醛酮化合物通常是由氣相或者液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)實現(xiàn)的(GC-或LC-MS)。因為這些分子在質(zhì)譜中的電離能力差，它們通常需要衍生化來提高檢測的靈敏度。例如，可以通過羰基與氨氧基(aminooxy group)的特異反應(yīng)或者羰基和氨基之間的還原性胺化反應(yīng)(reductive amination)引入叔胺或季胺。這樣可以顯著改善它們在質(zhì)譜正模式下的電離，從而大大提高質(zhì)譜檢測的靈敏度。同時，衍生法也允許引入穩(wěn)定同位素標(biāo)記，從而可以對不同生物樣品中的醛酮化合物進(jìn)行定量比較。但是，由于醛酮化合物在生物樣本中的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他類的代謝產(chǎn)物(例如：氨基酸和硫醇)，因此，復(fù)雜生物混合物中的醛酮合物的信號很容易被抑制，從而增加了檢測這類化合物的難度。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明公開了一種新型的測定生物樣品中醛酮化合物的衍生化方法。

為了解決在復(fù)雜生物樣品中精確定量測定醛酮化合物的種類和含量，本發(fā)明公開了一種新型的衍生化試劑，命名為CILAT(Cleavable Isobaric Labeled Affinity Tag)，可以從代謝物環(huán)境中選擇性標(biāo)記醛酮化合物。這個衍生化試劑由三部分組成：1)一個能夠與羰基進(jìn)行特異性反應(yīng)形成共價鍵的氨氧基官能團(tuán)；2)一個能夠被光裂解的生物素基團(tuán)用于標(biāo)記后的醛酮化合物的親和富集；3)一個含有穩(wěn)定同位素標(biāo)記的同量異位標(biāo)簽(Isobaric Tag)用于醛酮化合物的定量分析。這個衍生化試劑同時具有多種優(yōu)勢。例如，衍生化的醛酮化合物中也含有叔胺，可以增強(qiáng)待測化合物在質(zhì)譜中的離子化和靈敏度；生物素基團(tuán)的存在允許衍生化的醛酮化合物的富集純化，進(jìn)一步通過消除其他干擾來提高靈敏度；同量異位標(biāo)簽允許多個生物樣本中的醛酮化合物在一次實驗中同時定量，大大提高了樣品分析的通量。這個同量異位標(biāo)簽是CILAT試劑的一部分，其結(jié)構(gòu)包括報告基團(tuán)(reporter)和平衡基團(tuán)(balancer)，其中報告基團(tuán)和平衡基團(tuán)是通過MS/MS可剪切鍵連接。整套CILAT衍生化試劑可以包括2～10個化學(xué)結(jié)構(gòu)完全相同的分子，在每個分子中的同量異位結(jié)構(gòu)的不同位置處含有13C或15N同位素。報告基團(tuán)的質(zhì)量是不同的，但是報告基團(tuán)的不同質(zhì)量被平衡基團(tuán)所補(bǔ)償。這樣每個試劑中的報告基團(tuán)+平衡基團(tuán)的質(zhì)量是相同的。采用這樣的同量異位標(biāo)簽，多達(dá)10個生物樣品中的醛酮化合物可以在一次分析中定量。同時，由于不同生物樣本中的醛酮化合物被同量異位標(biāo)簽標(biāo)記后顯示同樣的質(zhì)量，因此在一級質(zhì)譜中不會引入額外的復(fù)雜性，能大大簡化數(shù)據(jù)分析。