[發明專利]一種堿性磷酸酶活性的熒光檢測方法

有效

• 申請號: 201910795469.1
• 申請日: 2019-08-27
• 公開（公告）號: CN110501317B
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 孫健;楊秀榮;劉國永;趙佳會;盧沙沙
• 申請（專利權）人: 中國科學院長春應用化學研究所
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/38
• 代理公司: 長春眾邦菁華知識產權代理有限公司 22214
• 代理人: 周蕾

本發明涉及一種堿性磷酸酶活性的熒光檢測方法，將4?羥基苯基磷酸鈉(4?HPP)作為底物，在水溶液中，該底物分子經堿性磷酸酶的催化水解生成1,4?苯二酚(HQ)，1,4?苯二酚可以與后續加入的3?(2?氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷(DAMO)發生反應，生成綠色熒光發射的硅納米粒子(SiNPs)。體系中的堿性磷酸酶活性越高，生成的熒光硅納米粒子就越多，熒光強度就越大，根據檢測溶液的熒光強度變化，進行堿性磷酸酶活性的定量分析檢測。與現有技術相比，本發明所需試劑藥品簡單易得，操作方便，快速準確，為臨床樣品中堿性磷酸酶活性定量檢測提供了一種靈敏可靠的方法。本發明的熒光檢測方法，檢出限為0.1mU/mL，具有高靈敏度，高選擇性，寬線性范圍等優點。

技術領域

本發明屬于分析檢測技術領域，具體涉及一種堿性磷酸酶活性的熒光檢測方法。

背景技術

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP，EC 3.1.3.1)是廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織經肝臟向膽外排出的一種酶，可以催化多種含磷酸酯基底物的去磷酸化過程，對于細胞生長、凋亡進程中的信號傳導和細胞內調節有極其重要的作用。堿性磷酸酶是反映肝膽、骨骼等系統疾病的重要指標，當人體患有黃疽、肝癌、膽汁淤積性肝炎等疾病時，血清中的堿性磷酸酶含量將會明顯升高；當發生骨折或患有骨軟化癥、佝僂病、骨細胞癌、骨質疏松等骨胳疾病時，血清中的堿性磷酸酶含量也會升高。因此，建立靈敏高效并能在臨床血液中進行檢測的堿性磷酸酶活性測定方法顯得尤為重要。

一直以來，許多分析化學和檢測技術的研究者致力于發展性能優良的分析方法用于堿性磷酸酶活性檢測。傳統檢測堿性磷酸酶活性的方法包括同位素標記法，操作復雜，耗時低效，且需要危害較大的放射性同位素標記物。之后，研究者又基于色譜法，比色法，化學發光法，電化學法，熒光法，表面增強共振拉曼散射等不同的分析技術創建了一系列堿性磷酸酶活性的檢測新方法。其中，熒光傳感技術由于其簡單靈敏、實時性和在體檢測等優勢，一直是人們的研究重點。目前的堿性磷酸酶熒光檢測方法，大多數通過繁瑣的有機合成，制備出較為復雜的底物分子，通過底物分子和堿性磷酸酶酶解產物之間的熒光差別來進行檢測。然而，基于商業化的簡單小分子，反應生成熒光物質的過程，構建的熒光“點亮”型生物分析技術，通常操作更加簡便，背景干擾更低，檢測靈敏度更高，因此基于這一原理發展的堿性磷酸酶檢測技術具有更好的應用前景。

發明內容

本發明的目的是提供一種堿性磷酸酶活性的熒光檢測方法，該檢測方法所用試劑簡單易得，操作方便，快速準確，靈敏度高。

為了實現上述目的，本發明的技術方案具體如下：

本發明提供一種堿性磷酸酶活性的熒光檢測方法，包括以下步驟：

步驟一：將4-羥基苯基磷酸鈉(4-HPP)水溶液分別與不同已知活性的堿性磷酸酶(ALP)標準溶液在緩沖溶液中混合孵育，得到一系列混合溶液；

步驟二：在步驟一制備的一系列混合溶液中分別加入3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷(DAMO)水溶液，進一步混合孵育，進行熒光光譜測試；

步驟三：利用堿性磷酸酶標準溶液活性和熒光光譜強度的線性關系，繪制標準曲線；

步驟四：將4-羥基苯基磷酸鈉(4-HPP)水溶液與待測堿性磷酸酶溶液在緩沖溶液中混合孵育，得到待測堿性磷酸酶混合溶液；

步驟五：在步驟四制備的待測堿性磷酸酶混合溶液中加入3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷(DAMO)水溶液，進一步混合孵育，進行熒光光譜測試，得到待測堿性磷酸酶的熒光光譜強度；

步驟六：利用步驟三的標準曲線及步驟五測得的熒光光譜強度，計算得到待測堿性磷酸酶的活性。

在上述技術方案中，優選堿性磷酸酶標準溶液的活性范圍為：0～50mU/mL。