[發明專利]一種新型孢子鞭毛染色液以及染色觀察方法

有效

• 申請號: 201910794671.2
• 申請日: 2019-08-27
• 公開（公告）號: CN110628865B
• 公開（公告）日: 2022-12-02
• 發明（設計）人: 史娟;姜粉霞;馬新
• 申請（專利權）人: 寧夏大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12M1/22;C12M1/12;C12M1/00;C12R1/645
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 陳娟

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種新型孢子鞭毛染色液以及染色觀察方法。所述的染色液為番紅或者固綠。一種新型孢子鞭毛染色觀察方法，其特征在于，首先材料需要再15度低溫下預培養1.5h，室溫下進行染色處理后置于20℃培養箱中染色30min，取出沖洗多余的染色液，吸干邊緣多余的液體，置于顯微鏡下觀察，可清晰地觀察到游動孢子的孢子鞭毛。建立霜霉病菌游動孢子鞭毛的染色技術，可為霜霉病菌游動孢子發育機制、靶向運動等相關研究提供支持。該方法具有操作步驟簡單，容易掌握，鞭毛觀察明顯，且不需要特殊設備即可進行。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種新型孢子鞭毛染色液以及染色觀察方法。

背景技術

霜霉菌在分類學上隸屬于卵菌。是一類形態和侵染特征與真菌類似的真核微生物。霜霉菌能夠侵染許多重要的農作物，引起的霜霉病常常給農戶造成巨大的經濟損失。

游動孢子是霜霉病菌最重要的侵染接種體，游動孢子依靠鞭毛進行運動并靶向寄主植物細胞,一旦接觸到寄主植物,即迅速休止并開始萌發，萌發的芽管往往形成附著胞類似結構,以利于進一步侵入寄主植物。因此，游動孢子鞭毛的觀察不僅是霜霉病菌生物學基礎研究中的重要內容，而且對于對于游動孢子發育機制的研究提供重要的依據。由于鞭毛是附屬結構，纖細，光學顯微鏡下不易觀察到，因此，尋求簡單易操作，觀察效果明顯的染色方法，對霜霉病菌游動孢子發育進而形成靜止孢子的機制研究是必須的，同時為深入研究鞭毛發育機制、超微結構等提供重要的觀察方法。細菌的鞭毛是重要的運動器官，細菌鞭毛的有無對于細菌的分類和鑒定是必須的，因此針對細菌的鞭毛染色技術很多。但是，卵菌不是原核微生物，由于卵菌的游動孢子沒有細胞壁，故現有的針對細菌鞭毛的染色方法并不能適用于霜霉病菌游動孢子鞭毛的染色觀察。

發明內容

發明的目的：為了提供一種效果更好的新型孢子鞭毛染色液以及染色觀察方法，具體目的見具體實施部分的多個實質技術效果。

為了達到如上目的，本發明采取如下技術方案：

一種新型孢子鞭毛染色液，其特征在于，所述的染色液為番紅或者固綠。

一種新型孢子鞭毛染色觀察方法，其特征在于，首先材料需要再15度低溫下預培養1.5h，室溫下進行染色處理后置于20℃培養箱中染色0.5h，取出沖洗多余的染色液，吸干邊緣多余的液體，置于顯微鏡下觀察，可清晰地觀察到游動孢子的孢子鞭毛。

本發明進一步技術方案在于，包含如下步驟，

染色液的配置配制：稱取番紅0.1g溶入蒸餾水中，定溶至100ml，裝入棕色滴瓶中，貼上標簽備用；稱取0.1g固綠溶入95%乙醇中，定溶至100ml，待全部溶解后轉移入棕色滴瓶中，貼標簽備用；

霜霉病菌的預培養：將田間采集的霜霉病葉在15-20度培養箱中進行保濕培養12h；采集標準：采集葉片正面具有鮮黃色的多角形病斑，葉背具有灰色至灰黑色或黑色的霜霉層即霜霉病菌的孢子囊梗或孢子囊，迅速裝入保濕袋中，防止葉片失水，影響孢子囊；或者是下午待太陽落山前進行霜霉病葉片采集，迅速裝入保濕袋中，防止葉片失水；帶回實驗室，葉柄用浸透蒸餾水的棉花包裹嚴實，放入15cm底部鋪有飽和水分的濾紙的培養皿中進行保濕培養，放入20度培養箱中保持培養12h；

孢子懸浮液的制備：將預培養的霜霉病菌，用潔凈的毛筆刷輕輕刷取霉層即病菌的孢子囊，避開葉片表皮細胞置于凹玻片上的滅菌水中，反復2-3次，蓋上蓋玻片，放入9cm的培養皿中保濕0.5h，≤26℃的室溫環境；

染色：用滴管吸取染色液，滴在凹玻片一邊，適度傾斜，讓染液進入凹玻片的滅菌水中，待凹玻片中的懸浮液呈均勻的紅色和藍色，放入培養皿中，置于20度培養箱中染色0.5h；

脫色：將滅菌水沿蓋玻片一邊緩緩滴入，洗去多余的染色液，用吸水紙擦干蓋玻片周圍多余的染色液；