[發(fā)明專利]一種結(jié)核分枝桿菌CFP-10抗原免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910794022.2
• 申請日: 2019-08-27
• 公開（公告）號: CN110687178B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李金龍;張永臣;張俠;許傳軍;胡凱
• 申請（專利權(quán)）人: 南京市第二醫(yī)院;南京鼓樓醫(yī)院
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32249
• 代理人: 馮慧

本發(fā)明通過靶標(biāo)循環(huán)策略和DNA模擬酶信號放大策略構(gòu)建了一種可以檢測結(jié)CFP10抗原的免疫傳感器，使用該檢測器的檢測方法具有以下優(yōu)勢：由于適配體與CFP10較強的結(jié)合性能，因此本發(fā)明具有極強的特異性；由于靶蛋白的循環(huán)利用和DNA模擬酶的辣根過氧化物酶活性，實現(xiàn)了較低CFP?10抗原檢測限(0.01ng.ml^?1)；該方法沒有使用到抗體及辣根過氧化物酶等，降低了檢測成本。本發(fā)明免疫傳感器利用該抗原的DNA適配體代替抗體，來實現(xiàn)該抗原的檢測，該電化學(xué)免疫傳感器利用DNA模擬酶作為信號放大元件，由于DNA空間結(jié)構(gòu)較小，可以富集在金納米顆粒表面，具有產(chǎn)生放大信號的作用，本發(fā)明所提出的CFP?10抗原檢測方法在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷中有著廣闊的應(yīng)用前景。

背景技術(shù)

結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染在經(jīng)濟發(fā)展落后的國家及地區(qū)形勢依然嚴(yán)峻，傳染率極高，且容易引起隱蔽性感染，所以發(fā)病率和死亡率居高不下。對于結(jié)核病的防控，除了需要及時的治療措施外，早期診斷，早期發(fā)現(xiàn)顯得尤為重要。因此，建立一種可以靈敏、快速檢測結(jié)核分枝桿菌的方法和傳感器一直是研究的熱點，對人類健康具有重要意義。研究者們已經(jīng)發(fā)展了多種診斷方法，如結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、結(jié)核菌素皮膚試驗和痰涂片顯微鏡檢查法，但都有其非常明顯的確定啊。例如，MTB診斷的金標(biāo)準(zhǔn)方法-結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，一般需要一個月甚至數(shù)月，對于結(jié)核病人的治療極為不利；結(jié)核菌素皮膚試驗，其特異性較低，雖然是目前最廣泛使用的方法，但不利于結(jié)核病的診斷；而痰涂片顯微鏡檢查方法既取決于痰標(biāo)本的質(zhì)量，又取決于痰標(biāo)本的細菌負荷，且靈敏度低。在過去的幾年里，雖然人們致力于改進結(jié)核病檢測方法，靈敏、快速的結(jié)核病檢測方法仍然是必要的。

為了克服傳統(tǒng)方法的缺點，近年來，人們發(fā)展了多種檢測新技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌抗原進行檢測以達到對結(jié)核分枝桿菌感染的診斷，如基于表面等離子體共振(SPR)的方法檢測結(jié)核分枝桿菌抗原和通過免疫傳感器檢測CFP10等結(jié)核分枝桿菌抗原。其中，基于電化學(xué)免疫傳感器方法逐漸引起了科研者的興趣，電化學(xué)免疫傳感器是利用電極表面的物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電子傳遞，根據(jù)電子傳遞的多少來對電極表面的反應(yīng)物質(zhì)進行定量，傳統(tǒng)的免疫傳感器利用電極表面修飾的酶標(biāo)記抗體來對抗原進行定量，隨著納米科技的發(fā)展，研究者逐漸將納米材料應(yīng)用到電化學(xué)免疫傳感器，可以實現(xiàn)酶的聚集，及各種信號放大策略的實施，因此該方法更具有靈敏度高、操作簡單等內(nèi)在的獨特優(yōu)勢。

中國專利CN201110056230.6公開了用于結(jié)核病血清學(xué)診斷的特異電化學(xué)免疫傳感器，該免疫傳感器是將免疫測定法與高靈敏的傳感技術(shù)相結(jié)合而構(gòu)建的一類新型生物傳感器，應(yīng)用于痕量免疫原性物質(zhì)的分析研究，基于前期的抗原標(biāo)記篩選工作，選定結(jié)核分枝桿菌Rv2175c基因編碼蛋白(下稱特異性抗原)作為特異性抗原，構(gòu)建高靈敏度電化學(xué)免疫傳感器,通過檢測人體血清中對應(yīng)該特異抗原的抗體而實現(xiàn)結(jié)核病血清學(xué)診斷。通過該免疫傳感器電流變化差異，該免疫傳感器能很好的將健康人和結(jié)核病患者區(qū)分開，達到血清學(xué)診斷目的，但該發(fā)明的檢應(yīng)用范圍還不夠廣泛，靈敏度也待提高。

免疫學(xué)方法對結(jié)核分枝桿菌進行檢測，主要通過對抗原的檢測實現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌抗原種類繁多，但是標(biāo)志性的抗原主要包括：結(jié)核桿菌抗原85A(Ag85A)，結(jié)核桿菌抗原85B(Ag85B)、及Ag85A、Ag85B和Ag85C組成的復(fù)合體抗原、人培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP10)和結(jié)核分枝桿菌分泌性蛋白(ESAT6)等，這些抗原的都有一個共同的特點：濃度低，需要靈敏度高的方法進行檢測。由于結(jié)核分枝桿菌抗原水平很低，現(xiàn)有的傳統(tǒng)免疫方法(如ELISA方法)存在檢測限的問題，很難檢測到如此低濃度的抗原，對于結(jié)核病的早期診斷是一個巨大挑戰(zhàn)，綜上，臨床上迫切需要一種高靈敏度的方法來對結(jié)核分枝桿菌抗原檢測，以達到為結(jié)核病的早期診斷提供依據(jù)。

因此，本發(fā)明構(gòu)建了一種雙信號放大的結(jié)核分枝桿菌抗原CFP10檢測的電化學(xué)免疫傳感器，結(jié)核病的早期、快速診斷奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容