[發明專利]一種結核分枝桿菌CFP-10抗原免疫傳感器及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201910794022.2
• 申請日: 2019-08-27
• 公開（公告）號: CN110687178B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 李金龍;張永臣;張俠;許傳軍;胡凱
• 申請（專利權）人: 南京市第二醫院;南京鼓樓醫院
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 馮慧

1.一種結核分枝桿菌CFP-10抗原免疫傳感器的制備方法，具體包括如下步驟：

(1)制備AuNPs-DNA復合物

1)將兩種不同的巰基化寡核苷酸經TCEP活化1-3h，得活化后的DNA溶液；

2)在步驟1)得到的活化后的DNA溶液中加入0.5-2mL的AuNPs，靜置10-14h后，再加入NaCl，并在37℃下搖動，使氯化鈉濃度達到0.3-0.8M，然后離心10-30min，沖洗去除未結合的DNA，制得AuNP S -DNA復合物，儲存在4℃備用；

(2)構建電化學免疫傳感器

1)制備金電極

a)金電極用氧化鋁粉末拋光，得到拋光后的電極；

b)將步驟2-1)-a)中拋光后的電極浸泡在水虎魚溶液中2-20min消除吸附的有機物，并用去離子水徹底清洗；

c)再將電極用50％硝酸浸泡10-30min，然后分別用乙醇和去離子水處理電極2-8min，再用氮氣吹干后，將電極浸入0.5M硫酸中，用循環伏安法從0到1.6V進行掃描直到獲得穩定的信號；

2)將步驟1)制得的金電極浸入含有0.6-2μM的DBCO-DNA緩沖液中孵育8-16h，然后用含有0.5-2mM MCH的水溶液處理20分鐘；

其中，DBCO-DNA的序列如SEQ ID.1所示；

3)用去離子水進一步多次沖洗步驟2)制得的電極并用氮氣吹干燥，再將電極輕輕浸入含有0.1-1μm的CFP-10適配體、互補-DNA混合的溶液中孵育0.5-2h，用去離子水清洗干凈，最后將電極浸入含有不同濃度的結核分枝桿菌CFP-10抗原和N3-DNA溶液中,其中N3-DNA的濃度為0.25μM，在37℃孵育40min，制得電極備用；

其中，CFP-10適配體的序列如SEQ ID.2所示；

其中，互補-DNA的序列如SEQ ID.3所示；

其中，N3-DNA的序列如SEQ ID.6所示；

4)將8-12μL步驟1制得的AuNPs -DNA復合物滴加在步驟2-3)制得的電極表面，保持37℃，0.5-2h，用PBS和去離子水依次清洗后，用氮氣吹干；

5)將hemin溶液滴加在上述電極表面，37℃，1-3h，形成DNA模擬酶，實現DNA模擬酶的富集；

(3)電化學免疫傳感器的檢測

1)工作電極為金電極，在660E電化學分析儀上進行電化學測量，差分脈沖伏安法在PBS中進行，而電化學阻抗譜實驗在鐵氰化鉀復合溶液和硝酸鉀中進行，實驗參數如下：對于DPV實驗，掃描范圍為-0.1V至0.2V。

2.如權利要求1所述的結核分枝桿菌CFP-10抗原免疫傳感器的制備方法，其特征在于，5′至3′端序列如下：

SEQ ID NO.1：Dibenzocyclooctyne(DBCO)-DNA,

SH-CGTACAACCAAC-DBCO；

SEQ ID NO.2：CFP-10aptamer(CFP-10Apt)：TCCTGAAAGGGGCCTGCCCCACTATCTCACATGGGGTTCAGTTGGTTGTACG；

SEQ ID NO.3：互補-DNA Complementary probe(CP)：TGAACCCCATGTGAGATAGTGGGGCAGGCCCCTTTCAGGA；

SEQ ID NO.4：DNA 1,TGGGTAGGGCGGGTTGGGTTTTTT-SH；

SEQ ID NO.5：DNA 2,GGGGCAGGCCCCTTTCAGGATTTTTT-SH；

SEQ ID NO.6：azide(N 3 )-DNA,N 3 -TGAACCCCATGTGAGATAGT。