[發(fā)明專利]地中?；【倚允删wvB_VmeM-Yong及其應用

在審

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• 申請日: 2019-08-14
• 公開（公告）號: CN112391358A
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發(fā)明（設計）人: 許麗華;李登峰;方靜;楊銳;童貽剛;秦偉南;林威;孫智同;徐夢雅
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02;A61K35/76;A61P31/04;C12R1/92
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• 代理人: 暫無信息

1.地中?；【囊环N烈性噬菌體vB_VmeM-Yong，該噬菌體于2019年1月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.17098。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的地中海弧菌的一種烈性噬菌體vB_VmeM-Yong，該噬菌體具有如下生物學特征：是首株以致病性地中?；【?17-T6為靶標分離獲得的噬菌體，亦是首株分離、鑒定的地中?；【删w，命名為vB_VmeM-Yong；vB_VmeM-Yong可感染并裂解致病性地中海弧菌117-T6，使菌液澄清化，在地中海弧菌117-T6平板上可以形成透明的噬菌斑。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的地中?；【囊环N烈性噬菌體vB_VmeM-Yong，該噬菌體具有如下生物學特征：呈現(xiàn)二十面體近似球形的頭部，直徑109nm(±9nm)，具有可收縮的尾部，長度320nm(±50nm)；潛伏期約為40min，裂解期約為40min-150min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的地中海弧菌的一種烈性噬菌體vB_VmeM-Yong，其特征包括：分離自浙江省寧波市北侖區(qū)梅山島表層海水，水樣采集的具體位置為North latitude：29.7831421；East longitude：121.9586032；具體制備方法如下：

(1)地中海弧菌117-T6的活化、培養(yǎng)

取117-T6菌種劃線接種于含1.5％瓊脂的海水營養(yǎng)固體培養(yǎng)基平板上，26℃倒置培養(yǎng)過夜；從平板上挑取單菌落，接種到裝有5mL海水營養(yǎng)培養(yǎng)基的試管內(nèi)，搖床上26℃、180rpm培養(yǎng)12小時；從試管中取1mL液體培養(yǎng)液稀釋至裝有100mL海水營養(yǎng)培養(yǎng)基的錐形瓶中，放置于搖床上26℃、180rpm擴大培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀≈0.6，即得到對數(shù)期菌液；

其中海水營養(yǎng)培養(yǎng)基配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，加入過濾海水定容至1L，pH7.2，高壓滅菌；

(2)噬菌體的富集

從浙江省寧波市北侖區(qū)梅山島海邊采集表層水樣，置冰盒內(nèi)，并立即帶回實驗室，充分顛倒混勻后，10000g離心10min，取上清80mL到250mL錐形瓶中，在錐形瓶中加入40ml 3×海水營養(yǎng)培養(yǎng)基和2mL新鮮培養(yǎng)的對數(shù)期117-T6菌液，混勻后放置于搖床上26℃、180rpm培養(yǎng)3-4小時進行噬菌體富集；將富集培養(yǎng)液離心4℃、10000g、10min，取上清液依次經(jīng)過0.45μm、0.22μm孔徑硝酸纖維素濾膜過濾，濾液即為的噬菌體富集液；

點板驗證：取融化狀態(tài)下于42-45℃保溫超過半小時的含0.7％瓊脂的海水營養(yǎng)培養(yǎng)基與500μL對數(shù)期117-T6菌液迅速混勻，立即傾倒于含1.5％瓊脂的海水營養(yǎng)培養(yǎng)基單層平板上，鋪平，冷卻凝固后，點2μL噬菌體原液于平板上，28℃過夜培養(yǎng)，翌日雙層平板上點噬菌體富集液出出現(xiàn)明顯透明噬菌斑；

噬菌體的進一步富集：取兩根試管，其中一根用作實驗組，添加如下組分：6mL上述噬菌體富集液、2mL 3×海水營養(yǎng)培養(yǎng)基、100μL新鮮的對數(shù)期117-T6菌液，對照組添加如下組分：8ml 1×海水營養(yǎng)培養(yǎng)基+100μL新鮮的對數(shù)期117-T6菌液；將試管置于26℃、180rpm搖床培養(yǎng)過夜；翌日，實驗組培養(yǎng)液較對照組明顯澄清，將培養(yǎng)液4℃、10000g離心10min，取上清液依次經(jīng)過0.45μm、0.22μm孔徑硝酸纖維素濾膜過濾，濾液即為的二次噬菌體富集液；

其中3×海水營養(yǎng)培養(yǎng)基配方：蛋白胨30g，牛肉膏9g，加入過濾海水定容至1L，pH7.2，121℃高壓滅菌20min；

(3)噬菌體的分離純化

將步驟(2)獲得的二次噬菌體富集液用海水營養(yǎng)培養(yǎng)基做10倍系列梯度稀釋，分別取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀釋度的稀釋液各100μL與200μL新鮮的對數(shù)期117-T6菌液混合，在室溫下，搖床上孵育10min，將該混合物加入至5ml的預先融化并在42-45℃保溫超過半小時的含0.7％瓊脂的半固體海水營養(yǎng)培養(yǎng)基中，立即充分混勻并傾倒于29℃預熱的含1.5％瓊脂的海水營養(yǎng)培養(yǎng)基單層平板上，均勻鋪平，待上層膠冷卻凝固后放于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，平板上有噬菌斑形成；選取噬菌斑密度合適的平板，挑取單個噬菌斑中心位置至5mL新鮮的對數(shù)期117-T6菌液中，搖床上28℃、180rpm過夜培養(yǎng)至宿主菌裂解澄清；將培養(yǎng)液離心10000g離心10min后，取上清液，依次經(jīng)過0.45μm、0.22μm孔徑硝酸纖維素濾膜過濾，過濾液即為新一代噬菌體原液；新噬菌體原液繼續(xù)使用上述雙層平板法重復進行三代噬菌體挖斑純化實驗，即得到純化培養(yǎng)的噬菌體vB_VmeM-Yong原液；

(4)噬菌體的擴大培養(yǎng)

將步驟(3)純化培養(yǎng)得到的vB_VmeM-Yong原液與新鮮的對數(shù)期117-T6菌液按體積200μL∶20mL的比例混合作為實驗組，設置20mL對數(shù)期117-T6菌液作為對照組，一起放置于搖床于26℃，180rpm培養(yǎng)，至實驗組與對照組液體比出現(xiàn)肉眼可見明顯差異時停止培養(yǎng)，將噬菌體vB_VmeM-Yong-菌培養(yǎng)裂解液置于4℃保存；

(5)噬菌體懸液制備

取步驟(4)制備的噬菌體vB_VmeM-Yong-菌培養(yǎng)裂解液在4℃、10000g離心10min，取上清液，依次經(jīng)過0.45μm、0.22μm孔徑硝酸纖維素濾膜過濾，即為噬菌體vB_VmeM-Yong懸液。