[發(fā)明專利]哈維氏弧菌高效裂解性噬菌體vB_VhaS-yong3及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910792952.4
• 申請(qǐng)日: 2019-08-14
• 公開（公告）號(hào): CN112391355A
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許麗華;李登峰;秦偉南;童貽剛;林威;孫智同
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;C12N7/02;A61K35/76;A61P31/04;C12R1/92
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.哈維氏弧菌的一種烈性噬菌體vB_VhaS-Yong 3，該噬菌體于2019年7月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.18195。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哈維氏弧菌的一種烈性噬菌體vB_VhaS-Yong 3，該噬菌體具有如下生物學(xué)特征：是首株以致病性哈維氏弧菌SZT為靶標(biāo)分離獲得的噬菌體，命名為vB_VhaS-Yong 3；vB_VhaS-Yong 3可感染并裂解致病性哈維氏弧菌SZT，使菌液澄清化，在哈維氏弧菌SZT的菌平板上可以形成透明的噬菌斑。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哈維氏弧菌的一種烈性噬菌體vB_VhaS-Yong 3，該噬菌體具有如下生物學(xué)特征：呈現(xiàn)二十面體近似球形的頭部，直徑約為65nm，尾部極其長(zhǎng)，約1.1um，其長(zhǎng)度超過了各文庫(kù)、網(wǎng)站中經(jīng)分離鑒定的所有弧菌噬菌體。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哈維氏弧菌的一種烈性噬菌體vB_VhaS-Yong 3，該噬菌體具有如下生物學(xué)特征：分離自貽貝消化囊，具體制備方法如下：

(1)哈維氏弧菌SZT株的活化、培養(yǎng)

取SZT菌種劃線接種于含2％瓊脂的LB海水固體培養(yǎng)基平板上，29℃倒置培養(yǎng)過夜；從平板上挑取單菌落，接種到裝有5mL LB海水培養(yǎng)基的試管內(nèi)，搖床上29℃、180rpm培養(yǎng)12小時(shí)；從試管中取1mL液體培養(yǎng)液稀釋至裝有100mL LB海水培養(yǎng)基的錐形瓶中，放置于搖床上29℃、180rpm，擴(kuò)大培養(yǎng)約3小時(shí)使菌液OD₆₀₀≈0.6，即得到對(duì)數(shù)期菌液；

其中LB海水培養(yǎng)基的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，用過濾海水定容至1L，調(diào)pH至7.2，121℃高壓滅菌20min；

(2)噬菌體的富集、分離

自浙江省寧波市鼓樓中心菜場(chǎng)購(gòu)買活貽貝，實(shí)驗(yàn)室解剖，取消化囊，在冰水浴中勻漿，加入5倍體積的LB海水培養(yǎng)基混勻后，離心4℃ 10000g 10min；取60mL上清液于錐形瓶中，在瓶中加入1mL對(duì)數(shù)期SZT菌液，混勻后放置于搖床上29℃、220rpm培養(yǎng)3小時(shí)，以進(jìn)行噬菌體初步富集；將培養(yǎng)液離心4℃ 10000g 10min，取上清液依次經(jīng)過0.45μm、0.22μm孔徑針頭過濾器過濾；取一支試管，加入4mL上述過濾液、2mL 3×LB海水液體培養(yǎng)基、100μL對(duì)數(shù)期SZT菌液混勻，作為實(shí)驗(yàn)組；另取一支試管加入6mL LB海水液體培養(yǎng)基、100μL對(duì)數(shù)期SZT菌液混勻，作為對(duì)照組；將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組試管放置于搖床上29℃、220rpm培養(yǎng)，至實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組液體有肉眼可見差異，即實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液變澄清、出現(xiàn)細(xì)菌碎片，取實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)或者4℃避光暫存；

其中，3×LB海水培養(yǎng)基的配方如下：胰蛋白胨30g，酵母提取物15g，用過濾海水定容至1L，調(diào)pH至7.2，121℃高壓滅菌20min；

(3)噬菌體的純化

將步驟(2)獲得的噬菌體培養(yǎng)液離心4℃ 10000g 10min，取上清液，依次經(jīng)過0.45μm、0.22μm孔徑針頭過濾器過濾后，用LB海水培養(yǎng)基做10倍梯度稀釋，取各稀釋度的稀釋液100μL分別與200μL對(duì)數(shù)期SZT菌液混合，放置于29℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育10min，使噬菌體吸附；從45℃水浴中取出一份4mL分裝的含0.7％瓊脂的LB海水培養(yǎng)基，立刻與孵育后的噬菌體-菌混合液混合，漩渦震蕩3秒混勻后，倒于已于37℃預(yù)熱30min以上的LB海水固體培養(yǎng)基平板上，均勻鋪平；待凝固后將雙層平板置于29℃培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)至平板上有噬菌斑形成；選取噬菌斑密度合適的平板，挑取單噬菌斑中心位置瓊脂置于5mL對(duì)數(shù)期SZT菌液中，搖床上29℃、220rpm培養(yǎng)至宿主菌裂解澄清；將培養(yǎng)液離心4℃ 10000g 10min后，取上清液，依次經(jīng)過0.45μm、0.22μm孔徑針頭過濾器過濾，過濾液即為新一代噬菌體原液；取新噬菌體原液繼續(xù)使用上述雙層平板法，重復(fù)進(jìn)行三代噬菌體純化實(shí)驗(yàn)，即得到純化培養(yǎng)的噬菌體vB_VhaS-yong 3原液；

(4)噬菌體的擴(kuò)大培養(yǎng)

將步驟(3)純化得到的噬菌體vB_VhaS-yong 3原液離心4℃ 10000g 10min，取上清液依次經(jīng)過0.45μm、0.22μm孔徑針頭過濾器過濾，將過濾液與對(duì)數(shù)期SZT菌液按體積200μL∶20mL的比例混合作為實(shí)驗(yàn)組，設(shè)置20mL對(duì)數(shù)期SZT菌液作為對(duì)照組，一起放置于搖床(上29℃ 220rpm培養(yǎng)，至實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組液體出現(xiàn)肉眼可見差異時(shí)停止培養(yǎng)；將噬菌體-菌培養(yǎng)裂解液置于4℃保存；

(5)噬菌體懸液制備

取步驟(4)制備的噬菌體-菌培養(yǎng)裂解液，離心4℃ 10000g 10min，取上清液，依次經(jīng)過0.45μm、0.22μm孔徑針頭過濾器過濾，即為噬菌體vB_VhaS-yong 3懸液。