[發明專利]曼氏血吸蟲蟲卵可溶性抗原的制備及其ELISA檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201910792330.1
• 申請日: 2019-08-26
• 公開（公告）號: CN110531063A
• 公開（公告）日: 2019-12-03
• 發明（設計）人: 朱傳剛;沈元曦;紀榮毅;林矯矯;洪煬
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所(中國動物衛生與流行病學中心上海分中心)
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535;G01N33/58;G01N33/543;G01N33/53;A01K67/033
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1.一種適合曼氏血吸蟲蟲卵分離純化的方法，所述方法為：

(1) 曼氏血吸蟲尾蚴感染適宜宿主，宿主包括但不限于小鼠；

(2)取感染6至10周的宿主動物器官，用于蟲卵的制備；

(3)分離及純化曼氏血吸蟲的蟲卵。

2.如權利要求1所述的適合曼氏血吸蟲蟲卵分離純化的方法，具體為：

感染后60d解剖小鼠，取各鼠的胃、肝臟、脾臟、腸等內臟組織，仔細分離除去粘附于各組織的血管、腸系膜等外在組織；將腸根據功能細分成小腸、盲結腸、直腸三段，其中小腸再均等地細分成上、下二段，清空腸道內容物；

剖殺，取肝臟等生物材料，剔除血管等結締組織后剪成1g左右的小塊，每鼠肝臟等生物材料加5-15ml（最適10ml）生理鹽水（pH值應為7.0～7.5），常溫下采用攪碎機制成勻漿液，勻漿轉速500-2000r/min，（最適2000r/min）勻漿時間1分鐘，間歇3分鐘，重復上述操作1-5次（最適合3次），獲得含蟲卵的肝臟等生物材料勻漿液；

上述肝臟等生物材料勻漿液按1:1-5比例（最適合1:1）加入45-60℃預熱的10%NaOH溶液（最適合50℃，下同），混勻，置于45-60℃水浴振蕩器內消化5-15分鐘（最適合8分鐘），震蕩轉速50-200r/min（最適合100r/min），消化結束后，迅速將消化的勻漿液插入2～8℃的冰水里降溫，3000r/min離心1-5分鐘，2～8℃操作，棄上清，加PBS(0.01M pH6.8)重懸沉淀后，重復上述操作離心洗滌1-3次（最適合3次），加PBS(0.01M pH7.2)重懸沉淀后，重復上述操作離心洗滌1-3次；最后用生理鹽水(0.9%NaC)重懸沉淀后，重復上述操作離心洗滌1-3次，收集蟲卵；

上述組織分別稱重后放入離心管中，加適量的蒸餾水，定容后用高速勻漿機勻漿，用細胞計數板計數蟲卵數，每樣計數三次。

3.一種曼氏血吸蟲蟲卵可溶性抗原的制備方法，所述方法為：

（1）將洗滌后離心獲得的蟲卵沉淀加按照1:1-5的體積比加入生理鹽水，研磨器內粉碎，鏡檢無完整蟲卵；-40℃至10℃反復凍融3次，冰上超聲，超聲1秒間隔9秒，共0.5-1小時，超聲后12000r/min離心5分鐘，取可溶性上清，即為蟲卵可溶性抗原粗提物，-20℃凍存；

生產前，將蟲卵可溶性抗原再次12000r/min離心5分鐘，上清即為檢測用蟲卵可溶性抗原；

（2）對蟲卵可溶性抗原的檢驗，其中上清性狀應為清亮半透明的液體；濃度檢測：通過Folin-酚試劑法測定抗原濃度應不低于1mg/ml。

4.如權利要求3所述的一種曼氏血吸蟲蟲卵可溶性抗原的制備方法，所述方法的最優反應條件為：

將洗滌后離心獲得的蟲卵沉淀加按照1:3的體積比加入生理鹽水，研磨器內粉碎，鏡檢無完整蟲卵；-40℃至10℃反復凍融3次，冰上超聲，超聲強度500w，超聲1秒間隔9秒，共0.5-1小時，超聲后12000r/min離心5分鐘，取可溶性上清，即為蟲卵可溶性抗原粗提物，-20℃凍存；

生產前，將蟲卵可溶性抗原再次12000r/min離心5分鐘，上清即為檢測用蟲卵可溶性抗原。

5.一種曼氏血吸蟲蟲卵純化抗原，其特征在于，采用根據權利要求3或4所述的一種曼氏血吸蟲蟲卵可溶性抗原的制備方法制備而成。

6.根據權利要求5所述的血吸蟲蟲卵純化抗原在制備檢測血吸蟲抗體的檢測產品中的應 用。

7.一種權利要求5 所述的曼氏血吸蟲蟲卵純化抗原在制備ELISA檢測試劑盒中的應用。

8.如權利要求7所述的應用，所述ELISA檢測試劑盒中蟲卵可溶性抗原最佳包被濃度為0.5μg/ml；最佳封閉液為PBST稀釋的5%的脫脂奶粉溶液；曼氏血吸蟲陽性血清和陰性血清最適合稀釋比為1:400。

9.一種非診斷目的的利用曼氏血吸蟲蟲卵純化抗原進行ELISA檢測的應用，所述應用包括：用包被液將蟲卵可溶性抗原，成蟲可溶性抗原稀釋至0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml，100μl/孔包被于96孔板上，2～8℃包被過夜；PBST洗滌三次，加入用PBST稀釋的5%的脫脂奶粉溶液，200μl/孔，37℃封閉2小時；PBST洗滌三次，加入1:100、1:200、1:300、1:400稀釋的曼氏血吸蟲陽性血清和血吸蟲陰性血清，80μl/孔，37℃孵育1小時；PBST洗滌三次，分別加入1:2000倍PBST稀釋的HRP標記的重組鏈球菌蛋白G，60μl/孔，37℃孵育30分鐘；PBST洗滌三次，加入TMB進行顯色，100μl/孔，37℃反應5分鐘左右；加入2mol/L H2SO4終止反應，50μl/孔，讀取OD450，計算P/N值，以P/N值≥2.1的血清判為陽性，以P/N值<2.1的血清判為陰性。