[發(fā)明專利]一種不依賴于酶的新型基因克隆方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910787163.1
• 申請日: 2019-08-25
• 公開（公告）號: CN110499310A
• 公開（公告）日: 2019-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 袁慧;田文奇
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州博睞恒生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
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本發(fā)明公開了一種不依賴于酶的新型基因克隆方法，包括步驟為：用引物擴增目標基因和質(zhì)粒載體；將目標基因擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒載體擴增產(chǎn)物進行碘酒熱處理；將熱處理后的目標基因DNA片段與質(zhì)粒載體DNA片段雜交配對，形成含目標基因的帶缺口重組質(zhì)粒；所述含目標基因的帶缺口重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，修復(fù)重組質(zhì)粒中的缺口，形成含目標基因的完整重組質(zhì)粒。通過上述方式，本發(fā)明采用最優(yōu)的硫代修飾與單鏈末端長度控制策略，含有目標基因的陽性克隆率高，操作通量大，適宜于多個目標基因同時克隆。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，特別是涉及一種不依賴于酶的新型基因克隆方法。

背景技術(shù)

基因克隆技術(shù)是蛋白質(zhì)工程、基因工程、基因編輯等技術(shù)的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)基因克隆技術(shù)涉及目標基因片段與質(zhì)粒載體的限制性核酸內(nèi)切酶消化、連接酶連接環(huán)化目標基因與質(zhì)粒這兩步必不可少的操作。傳統(tǒng)基因克隆技術(shù)缺點主要有：1）如果基因內(nèi)部具有選用的限制性酶切位點，則導致無法進行該基因的克隆，該問題對長片段的基因的克隆尤其明顯；2）不同基因選用的合適內(nèi)切酶不一樣，需要不同的限制性內(nèi)切酶進行處理，因此很難同時克隆多個基因；3）限制性核酸內(nèi)切酶消化反應(yīng)與DNA連接酶反應(yīng)，特別是限制性核酸內(nèi)切酶消化反應(yīng)，效率的高低直接決定著目標基因克隆能否成功。

由于限制性核酸內(nèi)切酶消化反應(yīng)與DNA連接酶反應(yīng)，常常造成含有目標基因的陽性重組質(zhì)粒百分比低于10%，甚至克隆失敗。為了克服常規(guī)基因克隆方法的缺陷，開發(fā)了一些連接酶非依賴性克隆方法，例如基于T4 DNA聚合酶的連接酶非依賴性克隆方法（NucleicAcids Research, Vol. 18, No. 20 p6069-6074），基于外切核酸酶的連接酶非依賴性克隆方法（Nucleic Acids Res 21: 5528-5529；Biotechniques 27: 1240-1244）。然而，基于T4 DNA聚合酶的連接酶非依賴性克隆方法缺點主要有：1）需要在目標基因與線性質(zhì)粒載體的5’端引入一段特定的堿基序列，導致克隆的目標基因的兩端附加了一段人為的堿基序列；2）引入的一段特定堿基序列有時較難設(shè)計，造成目標基因克隆困難。而基于外切核酸酶的連接酶非依賴性克隆方法的缺陷主要包括：DNA修飾酶對DNA的處理程度較難控制，不能有效控制單鏈突出端長度，常常會導致DNA的完全降解或降解達不到15個核苷酸，使得基因克隆失敗。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種不依賴于酶的新型基因克隆方法，其不需要包括限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶，以及用來生成單鏈突出端的核酸外切酶、DNA重組酶等任何DNA修飾酶，而是通過碘酒熱斷裂硫代修飾的目標DNA和克隆載體；該方法能簡化基因克隆操作、提高克隆效率與操作通量，可用于大規(guī)模基因克隆，可以用于重組載體構(gòu)建和基因點突變；同時相關(guān)試劑常溫儲存長期穩(wěn)定，儲存非常簡單方便。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是：提供一種不依賴于酶的新型基因克隆方法，包括步驟為：（1）用引物擴增目標基因和質(zhì)粒載體，其中引物序列的特征為：（a）5’端第1-25位間的磷酸二酯鍵為間隔性硫代修飾，相鄰硫代修飾間相隔5-8堿基；（b）擴增目標基因和質(zhì)粒載體的正向引物的5’端第1-25位間的堿基序列彼此互補配對，擴增目標基因和質(zhì)粒載體的反向引物的5’端第1-25位堿基序列彼此互補配對；（c）3’端下游18-25個堿基序列與待擴增的目標基因和質(zhì)粒載體的DNA片段兩端堿基序列配對；（2）將目標基因擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒載體擴增產(chǎn)物進行碘酒熱處理；（3）將熱處理后的目標基因DNA片段與質(zhì)粒載體DNA片段雜交配對，形成含目標基因的帶缺口重組質(zhì)粒；（4）所述含目標基因的帶缺口重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，修復(fù)重組質(zhì)粒中的缺口，形成含目標基因的完整重組質(zhì)粒。

在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟（1）中所述擴增采用的是聚合酶鏈式反應(yīng)PCR，擴增反應(yīng)緩沖液中包括有用于擴增目標基因和質(zhì)粒載體的正向引物、用于擴增目標基因和質(zhì)粒載體段的反向引物、目標基因與質(zhì)粒載體的DNA模板分子、DNA聚合酶、4種脫氧核苷三磷酸。