[發(fā)明專利]一種不依賴于酶的新型基因克隆方法

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• 申請日: 2019-08-25
• 公開（公告）號: CN110499310A
• 公開（公告）日: 2019-11-26
• 發(fā)明（設計）人: 袁慧;田文奇
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州博睞恒生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種不依賴于酶的新型基因克隆方法，其特征在于，包括步驟為：

（1）用引物擴增目標基因和質(zhì)粒載體，其中引物序列的特征為：（a）5’端第1-25位間的磷酸二酯鍵為間隔性硫代修飾，相鄰硫代修飾間相隔5-8堿基；（b）擴增目標基因和質(zhì)粒載體的正向引物的5’端第1-25位間的堿基序列彼此互補配對，擴增目標基因和質(zhì)粒載體的反向引物的5’端第1-25位堿基序列彼此互補配對；（c）3’端下游18-25個堿基序列與待擴增的目標基因和質(zhì)粒載體的DNA片段兩端堿基序列配對；

（2）將目標基因擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒載體擴增產(chǎn)物進行碘酒熱處理，在目標基因和線性化載體的硫代修飾處斷裂DNA中的磷酸二酯鍵，斷裂后形成的5-8個核苷酸的短鏈DNA從互補鏈上脫離，從而在DNA片段的兩端產(chǎn)生長度為10-25個核苷酸的3’突出端，單鏈的長度取決于距離5’端最遠的一個硫代修飾距離5’端的距離；（3）將熱處理后的目標基因DNA片段與質(zhì)粒載體DNA片段雜交配對，形成含目標基因的帶缺口重組質(zhì)粒；

（4）所述含目標基因的帶缺口重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，修復重組質(zhì)粒中的缺口，形成含目標基因的完整重組質(zhì)粒。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不依賴于酶的新型基因克隆方法，其特征在于，步驟（1）中所述擴增采用的是聚合酶鏈式反應PCR，擴增反應緩沖液中包括有用于擴增目標基因和質(zhì)粒載體的正向引物、用于擴增目標基因和質(zhì)粒載體段的反向引物、目標基因與質(zhì)粒載體的DNA模板分子、DNA聚合酶、4種脫氧核苷三磷酸。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不依賴于酶的新型基因克隆方法，其特征在于，所述不依賴于酶的新型基因克隆方法在步驟（1）和步驟（2）之間還包括對質(zhì)粒載體PCR產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶Dpn I消化去除質(zhì)粒模板。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不依賴于酶的新型基因克隆方法，其特征在于，步驟（2）中所述熱處理時的溫度為65-85℃，時間為1-15分鐘。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不依賴于酶的新型基因克隆方法，其特征在于，步驟（3）中所述雜交配對是在室溫下放置1～15分鐘。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不依賴于酶的新型基因克隆方法，其特征在于，所述不依賴于酶的新型基因克隆方法還包括對含目標基因的完整重組質(zhì)粒的鑒定：挑取單菌落，利用擴增目標基因的引物與Taq DNA聚合酶進行菌落PCR，鑒定含目標基因的完整重組質(zhì)粒的陽性克隆，培養(yǎng)陽性克隆，并抽提含目標基因的完整重組質(zhì)粒。