[發明專利]固定化酶催化法合成D-木酮糖

有效

• 申請號: 201910785092.1
• 申請日: 2019-08-23
• 公開（公告）號: CN110616239B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 黃華;張傳封;張興錕
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C12P19/02
• 分類號: C12P19/02;C12N15/70
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 郭煒綿

本發明公開了固定化酶催化法合成D?木酮糖，該方法從廉價的D?木糖和D?木糖醇出發，克隆了代謝途徑中相關的系列酶基因，發酵生產系列酶，經過純化和固定，然后加入相關起始原料，合成D?木酮糖。本發明采用固定化酶法，以廉價的木糖和木糖醇為原料高收率轉化成D?木酮糖；通過與木酮糖激酶的偶合催化不僅實現了原料的轉化完全，并且大大的方便了后期產品純化，而固定化酶的應用則進一步降低了生產成本并有利于規?；I生產。

技術領域

本發明涉及固定化酶催化法合成D-木酮糖，具體涉及利用固定化酶多步催化將D-木糖和D-木糖醇轉化成D-木酮糖的方法。

背景技術

D-木酮糖(D-Xylulose)是一種五碳酮糖，分子式為C₅H₁₀O₅，分子量為150；它是自然界廣泛存在的木糖(D-xylose)代謝的重要中間產物，通過與相應激酶作用轉化成磷酸木糖而后進入通用的磷酸戊糖代謝路徑。

D-木酮糖在人體的尿液、血液、腦脊髓液等部位被檢測出較高濃度，且發揮著有待探索的未知功能。與此同時，D-木酮糖通過脫水反應能較為方便地轉化成糠醛(furfural)，糠醛是當今熱門研究的一種可再生的生物能源及生物化工產品的起始原料，具有極大地市場發展前景。

市面上昂貴的價格(￥16000/克,Carbosynth公司)極大地限制了D-木酮糖在研究領域及工業應用領域的進一步發展，因此開發一種利用廉價原料(D-木糖:￥380/公斤；木糖醇:￥555/公斤,aladdin試劑)、簡易可放大的制備方法以降低其市場價格顯得比較重要。

D-木酮糖常規制備方法有提取法、化學合成法及發酵法。

但由于自然界中D-木酮糖豐度并不高，且極性大、水溶性高并混有很多類似糖分，因此分離提取純化方法成本高，該方法僅存在于早期D-木酮糖的研究中；后來隨著糖化學制備工藝的逐漸成熟,木酮糖也逐漸實現利用廉價的木糖醇選擇性氧化合成，然而由于木糖醇上多個羥基的存在，該方法中底物-OH的選擇性保護、氧化、脫保護使得整個合成工藝繁瑣復雜，生產成本居高不下。

由于無需考慮糖類化合物上的多個手性中心，酶法或發酵法制備該類化合物具有其獨特的優勢，日本的Ajinomoto公司利用一種葡糖桿菌屬(Gluconobacter)的酵母，以阿拉伯糖醇(D-Arabitol)為原料發酵生產D-木酮糖(US 6221634B1)，但是由于產品中混有木糖醇、木糖等其它類似單糖雜質導致最終純化成本高。

發明內容

為了克服現有技術無法低成本地、便捷地制備高純度D-木酮糖的缺陷，本發明的目的在于提供固定化酶催化法合成D-木酮糖。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種合成D-木酮糖的方法，包括以下步驟：

(1)PCR擴增木糖異構酶(XI)、木糖醇氧化酶(XDH)、木酮糖激酶(XK)、ATP再生酶(PPK)、乳酸脫氫酶(LDH)以及磷酸水解酶(AP)的基因片段，將所得基因片段分別連接到質粒上，轉入細胞中；細胞做抗性篩選，然后逐級擴大培養并誘導蛋白表達，分別收集含有上述各種酶的濕細胞；

所述的PCR擴增，是以大腸桿菌(Escherichia coli DH5a)菌株gDNA、包皮垢分支桿菌(Mycobacterium smegmatis ATCC 700084)染色體為模板；

所述的質粒優選pET28a；

所述的細胞優選E.coli BL21(DE3)菌株；

步驟(1)中，所述做抗性篩選和擴大培養采用的培養基都是LB液體培養基；做抗性篩選的培養基中還含有50μM卡那霉素；

所述的擴大培養，培養基中含有0.5mM IPTG，37℃誘導表達6小時；