[發明專利]固定化酶催化法合成D-木酮糖

有效

• 申請號: 201910785092.1
• 申請日: 2019-08-23
• 公開（公告）號: CN110616239B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 黃華;張傳封;張興錕
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C12P19/02
• 分類號: C12P19/02;C12N15/70
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 郭煒綿

1.一種合成D-木酮糖的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)以大腸桿菌DH5a菌株gDNA、包皮垢分支桿菌ATCC 700084染色體為模板，利用引物PCR擴增出木糖異構酶XI、木糖醇氧化酶XDH、木酮糖激酶XK、乳酸脫氫酶LDH、ATP再生酶PPK以及磷酸水解酶AP基因片段，然后通過酶切連接到pET28a質粒上，轉入細胞中；細胞做抗性篩選，然后逐級擴大培養并誘導蛋白表達，分別收集含有上述各種酶的濕細胞；

所述引物序列如下：

XI正向引物:5’-gattatggagttccatatgcaagcctattttg-3’

XI反向引物:5’-cgatatacatctcgagcgttccttaaaaaaatg-3’

XK正向引物:5’-gaaggacggacatatgacgtacctcctgaac-3’

XK反向引物:5’-gtcggtcgggcctcgagccgggtgaggtgc-3’

XDH正向引物:5’-gtcgaaaggtatttcatatgtccaatcaag-3’

XDH反向引物:5’-ctcggctcatcacagaagctttcgctatgc-3’

LDH正向引物:5’-catcactggagaaagtcatatgaaactcg-3’

LDH反向引物:5’-gaatgcaggggagcctcgagattaaaccag-3’

PPK正向引物:5’-gagcgggaggaagcatatggcactcgacg-3’

PPK反向引物:5’-ctgatcgtcagctcgagggaatcacctgag-3’

AP正向引物:5’-catggagaaaatcatatgaaacaaagcac-3’

AP反向引物:5’-aattcactgccgggctcgagtttatttcagc-3’；

(2)將收集的濕細胞高壓破碎、離心，在上清液中逐量加入硫酸銨直至蛋白固體析出；離心收集蛋白，純化，分別得到木糖異構酶XI、木糖醇氧化酶XDH、木酮糖激酶XK、乳酸脫氫酶LDH、ATP再生酶PPK、磷酸水解酶AP液體酶；

(3)將木糖異構酶XI、木酮糖激酶XK、ATP再生酶PPK按活性單位比1.0:(1.5～3.0):(3.0～6.0)溶解在緩沖液中，隨后加入環氧樹脂，室溫攪拌8小時以上，將酶固定在環氧樹脂上，得到固定化混合酶1；

將木糖醇氧化酶XDH、木酮糖激酶XK、ATP再生酶PPK、乳酸脫氫酶LDH四種酶按活性單位比1.0:(1.5-3.0):(3.0-6.0):(2.0-4.0)溶解在緩沖液中，隨后加入環氧樹脂，室溫攪拌8小時以上，將酶固定在環氧樹脂上，得到固定化混合酶2；

將磷酸水解酶AP溶解在緩沖液中，隨后加入環氧樹脂，室溫攪拌8小時以上，將酶固定在環氧樹脂上；

步驟(3)所述的緩沖液是pH值8.0的磷酸鉀溶液；

(4)在緩沖液中加入D-木糖、三磷酸腺苷二鈉鹽、多聚磷酸、氯化鎂和氯化鉀，調節pH值到6.5–8.5，加入固定化混合酶1，維持體系pH值在6.5-8.5，30℃攪拌3-5小時，過濾回收固定化酶，所得D-木酮糖-5-磷酸粗液進行純化；

在緩沖液中加入D-木糖醇、丙酮酸鈉、三磷酸腺苷二鈉鹽、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸單鈉鹽、多聚磷酸、氯化鎂和氯化鉀，調節pH值到6.0-9.0，加入固定化混合酶2，維持體系pH值在6.0-9.0，30℃攪拌2.5-5.5小時，過濾回收固定化酶，所得D-木酮糖-5-磷酸粗液進行純化；

步驟(4)所述的緩沖液是pH值8.0的Tris.HCl溶液；

步驟(4)所述的D-木酮糖-5-磷酸粗液進行純化，包括以下步驟：

往D-木酮糖-5-磷酸粗液中加入木糖或木糖醇1.1當量的草酸鋇并攪拌充分，隨后混入兩倍過濾液體積的乙醇溶液沉淀所有含磷酸成分，離心收集沉淀并將之溶解在pH值1.0的Tris緩沖溶液中，再加入草酸鋇等當量的無水硫酸鈉，離心除去BaSO₄沉淀，調節上清液pH值至7.0，用D201陰離子交換樹脂除去腺苷雜質，最后G25尺寸排阻柱脫鹽、凍干得到白色固體即為D-木酮糖-5-磷酸鈉純品；

(5)將D-木酮糖-5-磷酸鈉和氯化鎂加入緩沖液中，再加入固定化磷酸水解酶AP，20-40℃反應1.5-3.5個小時，然后過濾回收固定化磷酸水解酶AP，濾液過陰離子交換樹脂除去含磷酸雜質，D-核酮糖最先被洗脫出；最后經純化得到D-木酮糖純品；

步驟(5)所述的緩沖液是pH值7.0的Tris.HCl溶液。