[發明專利]一種生產子囊霉素的基因工程菌及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 201910784365.0
• 申請日: 2019-08-23
• 公開（公告）號: CN112410274B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發明（設計）人: 陳少欣;余志拓;楊松柏;張正玉;趙苗苗
• 申請（專利權）人: 上海醫藥工業研究院;中國醫藥工業研究總院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/00;C12N15/52;C12N9/02;C12N15/53;C12P17/18;C12R1/55
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;呂學辰

本發明提供了一種生產子囊霉素的基因工程菌，其為天然生產子囊霉素的吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中過表達accA2、accB和accE基因的工程菌。本發明還提供了該基因工程菌的制備方法和用途。利用本發明所述基因工程菌，可有效提高子囊霉素的產量；利用本發明所述基因工程菌生產子囊霉素，成本較低，適于工業化生產。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種生產子囊霉素的基因工程菌及其制備方法和用途。

背景技術

子囊霉素(ascomycin,FK520)產自吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicusvar.ascomyceticus ATCC 14891)，其化學式為C₄₃H₆₇NO₁₂，分子量為789.99，屬于大環內酯類化合物，具有良好的免疫抑制活性，其衍生物吡美莫斯作為治療特異性皮炎的一線藥物。目前子囊霉素主要通過微生物發酵法生產，但是發酵水平較低，限制了子囊霉素的臨床應用和市場前景。在天然生產子囊霉素的吸水鏈霉菌中，子囊霉素主要是聚酮合酶催化各類前體組成的，主要包括丙二酰-CoA、乙基丙二酰-CoA、甲基丙二酰-CoA、哌啶甲酸、二羥基環己烷羧酸等眾多前體。其中，丙二酰-CoA是由2分子的乙酰-CoA在乙酰-CoA羧化酶的作用下縮合而成。目前沒有報道在子囊霉素產生菌株中針對乙酰-CoA羧化酶進行定向改造以促進子囊霉素的合成。而乙基丙二酰-CoA則是由巴豆酰-CoA還原酶催化合成，目前已有專利和文獻報道使用外源巴豆酰-CoA還原酶整合到子囊霉素產生菌株中，提高子囊霉素的產量。但是已報道的子囊霉素發酵水平都很低，不能滿足工業化生產的需求。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是為了克服現有技術中微生物發酵法生產的子囊霉素產量較低的缺陷，提供了一種生產子囊霉素的基因工程菌及其制備方法和應用。利用本發明所述基因工程菌，可有效提高子囊霉素的產量；利用本發明所述基因工程菌生產子囊霉素，成本較低，適于工業化生產。

現有技術中提高子囊霉素產量的手段有很多種，對前體進行改進只是其中的一種輔助方式，并且這些針對前體的改造方式有很多種選擇，本發明人在經過大量的實驗后，意外發現可以從催化其中1個前體丙二酰-CoA的酶入手進行研究，并且從眾多的乙酰-CoA羧化酶編碼基因中選出特定的乙酰-CoA羧化酶編碼基因accA2、accB和accE(最早在天藍色鏈霉菌中被發現，accA2、accB和accE基因組合在一起共同組成一個完整的乙酰-CoA羧化酶)，將這些基因在子囊霉素產生菌株中進行過表達時，能夠顯著提高子囊霉素的產量。

為了解決上述技術問題，本發明的第一方面提供了一種生產子囊霉素的基因工程菌，其為天然生產子囊霉素的吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中過表達accA2、accB和accE基因的工程菌。

較佳地，所述基因工程菌為在所述天然生產子囊霉素的吸水鏈霉菌的基因組中整合了accA2、accB和accE基因的工程菌，所述整合的位點優選為attB位點，更優選ΦC31attB位點。

較佳地，所述基因工程菌為包含含有accA2、accB和accE基因的重組表達載體的工程菌；所述重組表達載體的骨架可以為質粒pSET-152。

較佳地，所述accB位于accE上游，所述accA2位于所述accB上游、或位于所述accE下游、或位于所述accB和所述accE之間。

較佳地，所述天然生產子囊霉素的吸水鏈霉菌為吸水鏈霉菌S.hygroscopicusvar.ascomyceticus ATCC 14891。

較佳地，所述accA2、accB和accE基因編碼的氨基酸序列的NCBI登錄號分別為NP_629074.1、NP_629669.1和NP_629670.1；更佳地，所述accA2、accB和accE基因的核苷酸序列的GeneID分別為1100362、1100975和1100976。