[發明專利]達氏鱘三個內參基因、引物開發及穩定性評價技術方法

在審

• 申請號: 201910766015.1
• 申請日: 2019-08-19
• 公開（公告）號: CN110295239A
• 公開（公告）日: 2019-10-01
• 發明（設計）人: 李志瓊;陳虎;汪斌;周波;唐妮;齊錦雯;陳德芳;王書瑤;吳源冰;田正志;王美;徐少奇
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 成都正華專利代理事務所(普通合伙) 51229
• 代理人: 何乃翹

本發明公開了一種基于轉錄組的準確、高效的真核生物基因鑒定方法，包括如下方法步驟：通過高保真酶的PCR擴增反應得到三個達氏鱘內參基因，對三個達氏鱘內參基因實時熒光定量引物的開發，通過標準曲線和熔解曲線評估三個達氏鱘內參基因引物的質量，評價三個達氏鱘內參基因在組織表達中的穩定性；該種基于轉錄組的準確、高效的真核生物基因鑒定方法，通過提供了三個內參基因ACT、GAPDH和EF1?α基因全長編碼區，為達氏鱘熒光定量研究提供了更多的內參基因選擇，利用ACT、GAPDH和EF1?α核苷酸序列為基礎開發了熒光定量引物，大大提高了熒光定量研究可靠性和可重復性，評價了ACT、GAPDH和EF1?α在組織表達中的穩定性，為達氏鱘熒光定量研究提供穩定適宜的內參基因。

本發明涉及一種基于轉錄組的準確、高效的真核生物基因鑒定方法，涉及分子生物學技術領域。

背景技術

達氏鱘主要分布在長江干支流及沿江大型湖泊中特有的國家一級保護動物，被列入《瀕危物種國際貿易公約》，是重要的生態保護物種和極具潛力的鱘魚產業資源。在2013年，攻克了達氏鱘的人工繁殖技術。目前，達氏鱘已開展了發育、營養等方面的部分研究，但分子層面的研究尚處于起步階段。

實時熒光定量PCR即qPCR是分子研究的常用技術。qPCR中的內參基因能夠校正樣本數、RNA質量、反轉錄過程、cDNA質量等多種因素對結果的影響。不同的試驗條件需要不同的內參基因。動植物中常用的內參基因包括β肌動蛋白(β-actin，ACT)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、和延伸因子1α(elongationfactor 1α，EF1-α)。目前，僅見達氏鱘部分ACT的相關報道，未見GAPDH和EF1-α相關報道。由于熒光定量過程中只能選擇ACT作為內參基因，但ACT并不是在所有實驗條件下都穩定表達，這對基因表達的校正和標準化產生了很大的影響，影響了功能基因研究結果的準確性。

此外，多個學者建議，為了校正熒光定量內參基因表達差異對研究結果的影響，需要采用兩個或兩個以上的內參基因進行校正和標準化。目前尚未發現達氏鱘ACT外的內參基因的相關報道，其內參基因十分缺乏。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有達氏鱘內參基因缺乏的問題，提供一種基于轉錄組的準確、高效的真核生物基因鑒定方法，從而解決上述問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種基于轉錄組的準確、高效的真核生物基因鑒定方法，包括β肌動蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和延伸因子1α三個達氏鱘內參基因，包括如下方法步驟：

步驟一，以絲瓜cDNA為模板、并以如下引物對進行高保真酶的PCR擴增反應得到三個達氏鱘內參基因，引物對為：

ACT正向引物5'-ATGGAAGACGAAATTGCCG-3'

ACT反向引物5'TTAGAAGCATTTACGGTGGACGA-3'

GAPDH正向引物5'-GAATCTCACTCAGACGAGGACTT-3'

GAPDH反向引物5'GGTGTGTGGTTTAAGTGATGTCA-3'

EF1-α正向引物5'-ATGGGAAAGGAAAAGACCCACATC-3'

EF1-α反向引物5'GGACAGTCCAGGGGATGGTGGTT-3'

步驟二，三個所述達氏鱘內參基因實時熒光定量引物的開發，以步驟一中達氏鱘內參基因的核苷酸序列為基礎，利用Primer Premier5.0軟件、并遵循實時熒光定量PCR引物設計的原則設計出一對熒光定量特異引物，該對熒光定量特異引物即為所述實時熒光定量PCR引物，實時熒光定量PCR引物對如下：

qACT正向引物5'-CTGTTTCAGCCATCCTTCTTG-3'