[發明專利]達氏鱘三個內參基因、引物開發及穩定性評價技術方法

在審

• 申請號: 201910766015.1
• 申請日: 2019-08-19
• 公開（公告）號: CN110295239A
• 公開（公告）日: 2019-10-01
• 發明（設計）人: 李志瓊;陳虎;汪斌;周波;唐妮;齊錦雯;陳德芳;王書瑤;吳源冰;田正志;王美;徐少奇
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 成都正華專利代理事務所(普通合伙) 51229
• 代理人: 何乃翹

1.一種基于轉錄組的準確、高效的真核生物基因鑒定方法，包括β肌動蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和延伸因子1α三個達氏鱘內參基因，其特征在于，包括如下方法步驟：

步驟一，以絲瓜cDNA為模板、并以如下引物對進行高保真酶的PCR擴增反應得到三個達氏鱘內參基因，引物對為：

ACT正向引物5'-ATGGAAGACGAAATTGCCG-3'

ACT反向引物5'TTAGAAGCATTTACGGTGGACGA-3'

GAPDH正向引物5'-GAATCTCACTCAGACGAGGACTT-3'

GAPDH反向引物5'GGTGTGTGGTTTAAGTGATGTCA-3'

EF1-α正向引物5'-ATGGGAAAGGAAAAGACCCACATC-3'

EF1-α反向引物5'GGACAGTCCAGGGGATGGTGGTT-3'

步驟二，三個所述達氏鱘內參基因實時熒光定量引物的開發，以步驟一中達氏鱘內參基因的核苷酸序列為基礎，利用Primer Premier5.0軟件、并遵循實時熒光定量PCR引物設計的原則設計出一對熒光定量特異引物，該對熒光定量特異引物即為所述實時熒光定量PCR引物，實時熒光定量PCR引物對如下：

qACT正向引物5'-CTGTTTCAGCCATCCTTCTTG-3'

qACT反向引物5'TTGATTTTCATTGTGCTCGGT-3'

qGAPDH正向引物5'-TCAAATGGGGTGATGCTGGAG-3'

qGAPDH反向引物5'GCGGAGATGATGACACGCTTAG-3'

qEF1-α正向引物5'-GAAAGGAAAAGACCCACAT-3'

qEF1-α反向引物5'CCAGGCATACTTGAAGGAGC-3'

步驟三，通過標準曲線和熔解曲線評估三個達氏鱘內參基因引物的質量，

步驟四，使用但不限于geNorm，NormFinder和Bestkeeper軟件評價三個達氏鱘內參基因在組織表達中的穩定性。

2.根據權利要求1所述的一種基于轉錄組的準確、高效的真核生物基因鑒定方法，其特征在于，所述步驟一中的高保真酶包括但不限于Pfu，Pfu和Ultra，也可使用高保真mix。

3.根據權利要求1所述的一種基于轉錄組的準確、高效的真核生物基因鑒定方法，其特征在于，所述步驟一中的PCR產物直接測序若存在不準確，可使用克隆到載體中進行測序。

4.根據權利要求1所述的一種基于轉錄組的準確、高效的真核生物基因鑒定方法，其特征在于，所述步驟二中設計的引物設計原則包括：擴增片段長度在110-210bp，上下游引物差異不超過1個堿基，擴增效率在90％-100％，R2大于或等于0.995。

5.根據權利要求1所述的一種基于轉錄組的準確、高效的真核生物基因鑒定方法，其特征在于，所述步驟二中的引物設計軟件不僅限于Primer Premier5.0軟件。