[發明專利]不同種屬球蟲對藥物敏感性的快速檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201910762404.7
• 申請日: 2019-08-19
• 公開（公告）號: CN110317892A
• 公開（公告）日: 2019-10-11
• 發明（設計）人: 費陳忠;張麗芳;薛飛群;谷峰;張可煜;王霄旸;王米;王春梅;劉迎春;張敏;李雪雁
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所（中國動物衛生與流行病學中心上海分中心）
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/90
• 代理公司: 上海序倫律師事務所 31276
• 代理人: 周東萍

本發明公開了一種不同種屬球蟲對藥物敏感性的快速檢測方法，包括以下步驟：構建針對不同種屬待檢球蟲的TaqMan實時熒光定量PCR分析方法；采集臨床測試球蟲樣品，并分離出球蟲卵囊；進行抗球蟲藥物臨床試驗；通過分析藥物試驗前后樣品球蟲種群的組成及其所占比例的變化，獲得不同種屬待測球蟲對藥物的敏感性結果。本發明的快速檢測方法，可以避免傳統方法中需要數月才能完成的分離單個球蟲的繁瑣步驟，僅需幾天時間，就能直接獲得不同種屬球蟲的藥物敏感性和抗藥性試驗結果，大大節省工作時間和人力物力，有利于臨床球蟲病的更好防控。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種不同種屬球蟲對不同抗球蟲藥物敏感性的快速檢測方法及試劑盒。

背景技術

球蟲病是由一種或多種球蟲寄生于動物腸道等不同部位所引起的，以生長發育遲緩和腸黏膜等嚴重損傷為特征的寄生蟲病。其中，雞球蟲病是由頂復門寄生蟲中的艾美耳球蟲(Eimeria)引起的一種或數種單細胞寄生原蟲寄生于雞腸道上皮細胞內所引起的疾病，是我國集約化養雞場最常見的疾病，也是6-10％肉雞死亡的主要原因，凡是養雞的地方，就有雞球蟲的存在，每年全世界因雞球蟲造成的經濟損失超過30億美元，我國每年有該病所致的經濟損失在50億人民幣以上。

雞球蟲為胞內專性寄生蟲，其種類較多，目前大家所公認且最為常見的有7種雞艾美耳球蟲，分別是柔嫩(Eimeria tenella)、毒害(E.necatrix)、和緩(E.mitis)、布氏(E.brunetti)、堆型(E.acervulina)、巨型(E.maxima)和早熟艾美耳球蟲(E.praecox)。不同種雞艾美耳球蟲在體內寄生部位、裂殖代數、卵囊形態、致病力和潛伏期等方面都不盡相同，通常E.tenella寄生于雞盲腸中，E.acervulina和E.maxima主要寄生于十二指腸和小腸前段，E.necatrix寄生于小腸中斷，E.mitis和E.praecox分別寄生于小腸前段和十二指腸及小腸前段。而就致病性來說，高致病性的有E.tenella和E.necatrix，中等致病性主要是E.acervulina和E.maxima，而E.brunetti、E.mitis和E.praecox的致病力相對較弱。雞球蟲病的防治主要依賴于飼料中的化學藥物的添加，因此也導致了臨床耐藥蟲株的普遍出現和獸藥殘留的危害風險，據報道，我國養禽業用于防治雞球蟲的費用約占總的禽病防治費用的三分之一。

兔球蟲病由寄生于筋道和膽管上皮細胞的艾美耳屬球蟲引發,主要包括小型艾美耳球蟲(E.exigua)、中型艾美耳球蟲(E.media)、黃艾美耳球蟲(E.flavescens)、大型艾美耳球蟲(E.magna),盲腸艾美耳球蟲(E.coecicola)、斯氏艾美耳球蟲(E.stiedai)等等，其中斯氏艾美耳球蟲呈世界性流行,在我國的感染率和死亡率較高，造成了養兔業的的巨大經濟損失。

抗球蟲藥物主要分為化學合成類和聚醚離子載體類，化學合成類主要有地克珠利Diclazuril、妥曲珠利Toltrazuril、二硝托胺、氯羥吡啶、癸氧喹酯、丁氧喹啉、尼卡巴嗪、氯苯胍、磺胺氯吡嗪、磺胺喹惡啉、氨丙啉、常山酮等。聚醚離子載體類主要有鹽霉素、甲基鹽霉素、莫能菌素、馬杜霉素、拉沙羅菌素等。不同的抗球蟲藥物對不同種屬的球蟲其本身具有不同的敏感性，如二硝托胺對柔嫩、毒害艾美耳球蟲作用較強,對堆型艾美耳球蟲的作用較弱，而氨丙林只對柔嫩艾美耳球蟲有效等等，同時，球蟲的抗藥性產生也同樣有種屬的差異。

臨床的球蟲感染絕大部分是兩種以上不同種屬的混合感染，對臨床樣品進行的抗球蟲藥物有效性和敏感性試驗，其結果通常只是針對混合感染而言，而不能了解對具體不同感染種屬球蟲的有效性和敏感性。當需要了解藥物對具體某一特定球蟲種屬的抗藥性和敏感性時，傳統方法必須耗費大量人力物力首先進行球蟲種屬的分離和鑒定，繼而采用分離后的蟲種進行感染和相應的藥物試驗，以確定特定種屬球蟲的藥物有效性和敏感性。該傳統方法中，繁瑣的球蟲單卵囊分離技術，耗時耗力，至少需要數月時間才能完成分離鑒定工作，而且必須一個個蟲種進行藥物試驗，工作量巨大。

發明內容