[發明專利]不同種屬球蟲對藥物敏感性的快速檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201910762404.7
• 申請日: 2019-08-19
• 公開（公告）號: CN110317892A
• 公開（公告）日: 2019-10-11
• 發明（設計）人: 費陳忠;張麗芳;薛飛群;谷峰;張可煜;王霄旸;王米;王春梅;劉迎春;張敏;李雪雁
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所（中國動物衛生與流行病學中心上海分中心）
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/90
• 代理公司: 上海序倫律師事務所 31276
• 代理人: 周東萍

1.一種不同種屬球蟲對藥物敏感性的快速檢測方法，包括以下步驟：

構建針對不同種屬待檢球蟲的TaqMan實時熒光定量PCR分析方法；

采集臨床測試球蟲樣品，并分離出球蟲卵囊；

進行抗球蟲藥物臨床試驗，設感染用藥組、感染不用藥組和不感染不用藥的健康對照組，感染試驗組每個實驗動物口服接種所述分離的待測樣品的孢子化球蟲卵囊，感染用藥組飼喂添加抗球蟲藥的飼料，感染不用藥組飼喂無藥物添加飼料；

分別收集感染后的各組試驗動物糞便，并分離收集卵囊和提取基因組，采用所述構建的方法進行相應的熒光定量PCR檢測，通過分析藥物試驗前后，樣品中球蟲種群的組成及其所占比例的變化，獲得不同種屬待測球蟲對藥物的敏感性結果。

2.根據權利要求1所述的快速檢測方法，其特征在于，所述構建TaqMan實時熒光定量PCR分析方法包括以下步驟：

針對不同種屬球蟲的特異基因設計熒光定量PCR引物對和TaqMan探針；

分別提取不同種屬的純種球蟲的基因組，用所述引物對分別擴增出對應球蟲的目的基因片段，將該目的基因片段連接到空載體中，形成標準重組質粒；

將分別含有不同種屬球蟲目的基因的標準重組質粒，用無核酸酶的水進行10倍倍比稀釋，質粒的稀釋濃度范圍為1×10¹～1×10⁹質粒拷貝數，然后選出拷貝數是1×10²～1×10⁸的8個梯度作為模板進行熒光定量PCR反應；

反應結束，得到每個拷貝數對應的CT值，計算標準曲線。

3.根據權利要求2所述的快速檢測方法，其特征在于，所述引物對和探針包括下述任意一組或兩組以上組合：

引物對SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和探針SEQ ID NO:3；

引物對SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和探針SEQ ID NO:6；

引物對SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和探針SEQ ID NO:9；

引物對SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和探針SEQ ID NO:12；

引物對SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和探針SEQ ID NO:15；

引物對SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和探針SEQ ID NO:18；

引物對SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和探針SEQ ID NO:21。

4.根據權利要求1所述的快速檢測方法，其特征在于，所述感染試驗組每個實驗動物口服接種5～20萬分離的待測樣品孢子化球蟲卵囊。

5.一種快速檢測不同種屬球蟲對藥物敏感性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：針對不同種屬球蟲的特異基因設計的熒光定量PCR引物對和TaqMan探針，該引物對和探針包含下述任意一組或兩組以上組合：

引物對SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和探針SEQ ID NO:3；

引物對SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和探針SEQ ID NO:6；

引物對SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和探針SEQ ID NO:9；

引物對SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和探針SEQ ID NO:12；

引物對SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和探針SEQ ID NO:15；

引物對SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和探針SEQ ID NO:18；

引物對SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和探針SEQ ID NO:21。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：分別含有不同種屬球蟲目的基因的標準重組質粒。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述標準重組質粒的空載體為pEASY-T1載體。