[發明專利]一種蘋果輪紋病菌的接種方法

在審

• 申請號: 201910761711.3
• 申請日: 2019-08-19
• 公開（公告）號: CN110387336A
• 公開（公告）日: 2019-10-29
• 發明（設計）人: 黃永紅
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;A01G7/06;C12Q1/18;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 馬金華

本發明公開了一種蘋果輪紋病病菌的接種方法，包括蘋果輪紋菌液獲得，菌液接種蘋果果實，最后接種枝條。其中PDA液體培養基配方為馬鈴薯200g；葡萄糖20g；蒸餾水1000mL。本發明的有益效果是能夠補充或者替代目前多數研究中用菌餅接種蘋果輪紋病的方法，可以大量而且準確地接種，具有簡單、高效的特點。

技術領域

本發明屬于農業技術領域，涉及一種蘋果輪紋病菌的接種方法。

背景技術

目前，蘋果輪紋病成為嚴重限制我國蘋果產業健康持續發展的重要因素之一。2008年，對山東等我國7個蘋果主產省市的88個果園調查結果顯示，蘋果輪紋病總體發病率為77.6％，其中山東省、河南省發病率均高達100％。輪紋病菌侵染枝干，形成病瘤，粗皮以及干腐狀病癥，嚴重影響樹勢，最終可導致樹體或者枝條死亡；輪紋病菌侵染果實，嚴重時果實腐爛，導致產量和品質嚴重下降。據報道，一般年份，常規園采收的果實病果率為12-20％，常溫下貯藏1個月后，病果率可達50-60％。蘋果輪紋病菌不僅侵染田間生長的蘋果，而且由于其潛伏侵染特性，還可引起蘋果采后腐爛，成為貯藏期的重要病害。因此，蘋果輪紋病被認為是80年代以來最嚴重的爛果病害之一，給果農及蘋果產業造成了巨大的損失。亟待研發更好的防控措施，以促進我國蘋果產業健康穩定發展。

研發病害防控措施的必要手段是借助于人工接種技術。而獲得大量的孢子是人工接種的第一步。孢子可以通過洗滌氣生菌絲，或者振蕩培養等簡易方法獲得。但是蘋果輪紋病的病原菌葡萄座腔菌(Botryosphaeria spp.)一般條件下不易產生孢子。其常規的產孢方法是將病原菌接種在PDA培養基上，刮傷菌絲，紫外光(254nm)或黑光(365nm)照射。也可以接種幼果，轉入黑光燈下培養獲得。但是這些方法誘導時間長，并且需要一定的設備條件，誘導產孢量少,且效果不穩定,難以滿足大批量接種試驗的需求。這影響了對其生物學特性、致病機理和藥劑毒理的研究，繼而也影響了該病防控措施的研發。

目前由于蘋果輪紋病病菌誘導孢子比較困難，因此大多數報道的相關研究中用PDA培養基上獲得的菌餅替代孢子進行人工接種。為此，我們發明了一種補充或者替代菌餅接種的方法，可以大量而且準確地接種，進行相關研究。該技術具有簡單、高效的特點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種蘋果輪紋病菌的接種方法，本發明的有益效果是能夠補充或者替代目前多數研究中用菌餅接種蘋果輪紋病的方法，可以大量而且準確地接種，具有簡單、高效的特點。

本發明所采用的技術方案是按照以下步驟進行：

步驟1：蘋果輪紋菌液獲得：

在超凈工作臺中，取無菌PDA液體培養基加入高溫滅菌的三角瓶中，用無菌的尖頭小鑷從平板上培養的蘋果輪紋病菌上挑取少許菌絲，放入三角瓶中，用封口膜封好，置于搖床中培養，蘋果輪紋病菌菌絲產生菌絲球狀物；在超凈工作臺中，取無菌PDA液體培養基加入無菌離心管，再從三角瓶中的培養物中夾取兩三個菌絲球狀物放入離心管中；取一大燒杯，加滿冰塊，將上述離心管插入冰塊中并固定于燒杯中；將燒杯放入超聲波細胞細胞破碎儀的隔音箱中，用酒精棉球擦洗探頭，將探頭沒過液體，將菌絲球狀物破碎為乳液狀；

步驟2：菌液接種蘋果果實：

選取大小一致、無損傷的富士蘋果果實，將果實用酒精擦拭進行表面消毒，然后用無菌水沖洗，室溫風干；在赤道處相對位置用打孔器打兩個孔，用移液槍吸取破碎的菌液加入一個孔中，另一個孔中加等量的PDA液體培養基做對照；將處理和對照分別用保鮮膜纏好，裝入紙箱中培養，觀察發病情況；

步驟3：接種枝條：

選取枝條嫩梢，洗凈后用酒精消毒，無菌水沖洗，在枝條上用尖頭小鎳將嫩梢刺傷；吸取破碎的菌液加入嫩梢的一個刺傷部位；在另一個傷口處，加入等量的液體PDA培養基作對照，將處理和對照用保鮮膜纏好，嫩梢底部用脫脂棉包住，然后在脫脂棉上加入無菌水；放入托盤中，將托盤用保鮮膜覆蓋培養，觀察發病情況。