[發(fā)明專利]一種蘋果輪紋病菌的接種方法

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• 申請日: 2019-08-19
• 公開（公告）號: CN110387336A
• 公開（公告）日: 2019-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃永紅
• 申請（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;A01G7/06;C12Q1/18;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京匯捷知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11531
• 代理人: 馬金華

1.一種蘋果輪紋病病菌的接種方法，其特征在于按照以下步驟進(jìn)行：

步驟1：蘋果輪紋菌液獲得：

在超凈工作臺中，取PDA液體培養(yǎng)加入高溫滅菌的三角瓶中，用無菌的尖頭小鑷從平板上培養(yǎng)的蘋果輪紋病菌上挑取少許菌絲，放入三角瓶中，用封口膜封好，置于搖床中培養(yǎng)，蘋果輪紋病菌菌絲產(chǎn)生菌絲球狀物；在超凈工作臺中，取PDA液體培養(yǎng)基加入離心管，再從三角瓶中培養(yǎng)物中夾取兩三個菌絲球狀物放入離心管中；取一大燒杯，加滿冰塊，將上述離心管插入冰塊中并固定于燒杯中；將燒杯放入超聲波細(xì)胞細(xì)胞破碎儀的隔音箱中，用酒精棉球擦洗探頭，將探頭沒過液體，將菌絲球狀物破碎為乳液狀；

步驟2：菌液接種蘋果果實(shí)：

選取大小一致、無損傷的富士蘋果果實(shí)，將果實(shí)用酒精擦拭進(jìn)行表面消毒，然后用無菌水沖洗，室溫風(fēng)干；在赤道處相對位置用打孔器打上兩個孔，用移液槍吸取破碎的菌液加入一個孔中，另一個孔中加入等量PDA液體培養(yǎng)基做對照；將處理和對照分別用保鮮膜纏好，裝入紙箱中培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況；

步驟3：接種枝條：

選取枝條嫩梢，洗凈后用酒精消毒，無菌水沖洗，在枝條上用尖頭小鎳將嫩梢刺傷；吸取破碎的菌液加入嫩梢的一個刺傷部位；在另一個傷口處，加入液體PDA培養(yǎng)基作對照，將處理和對照用保鮮膜纏好，嫩梢底部用脫脂棉包住，然后在脫脂棉上加入無菌水；放入托盤中，將托盤用保鮮膜覆蓋培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。

2.按照權(quán)利要求1所述一種蘋果輪紋病病菌的接種方法，其特征在于：所述步驟1：蘋果輪紋菌液獲得：

在超凈工作臺中，取50mL無菌的PDA液體培養(yǎng)基加入高溫滅菌的100mL三角瓶中，用無菌的尖頭小鑷從平板上培養(yǎng)的蘋果輪紋病菌上挑取少許菌絲，放入三角瓶中，用封口膜封好，置于搖床中28℃、200rpm培養(yǎng)3d后，輪紋病菌菌絲產(chǎn)生直徑為0.5-2cm不等的菌絲球狀物；在超凈工作臺中，取30mL PDA液體培養(yǎng)基加入50mL的離心管，再從三角瓶中培養(yǎng)物中夾取兩三個菌絲球狀物放入50mL離心管中；取一大燒杯，加滿冰塊，將上述50mL離心管插入冰塊中并固定于燒杯中；將燒杯放入超聲波細(xì)胞細(xì)胞破碎儀的隔音箱中，用酒精棉球擦洗探頭，將探頭沒過液體2cm左右，設(shè)置超聲時間3s，間隔時間5s，工作次數(shù)90次，將菌絲球狀物破碎為乳液狀。

3.按照權(quán)利要求1所述一種蘋果輪紋病病菌的接種方法，其特征在于：所述步驟2：菌液接種蘋果果實(shí)：

選取大小一致、無損傷的富士蘋果果實(shí)，將果實(shí)用75％酒精擦拭進(jìn)行表面消毒，然后用無菌水沖洗，室溫風(fēng)干；在赤道處相對位置用5mm的打孔器打上兩個5mm深的孔，用移液槍吸取20μL破碎的菌液加入一個孔中，另一個孔中20μL PDA液體培養(yǎng)基做對照；將處理和對照分別用保鮮膜纏好，裝入紙箱中，28℃培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。

4.按照權(quán)利要求1所述一種蘋果輪紋病病菌的接種方法，其特征在于：所述步驟3：接種枝條：

選取枝條嫩梢，洗凈后用75％酒精消毒30s，無菌水沖洗四次，在枝條上相隔10cm，用尖頭小鎳將嫩梢刺傷；吸取20μL破碎的菌液加入嫩梢的一個刺傷部位；在另一個傷口處，加入20μL液體PDA培養(yǎng)基作對照，將處理和對照用保鮮膜纏好，嫩梢底部用脫脂棉包住，然后在脫脂棉上加入1mL無菌水；放入托盤中，將托盤用保鮮膜覆蓋，28℃培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。

5.按照權(quán)利要求1所述一種蘋果輪紋病病菌的接種方法，其特征在于：所述PDA液體培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g；葡萄糖20g；蒸餾水1000mL。