[發明專利]鴿新城疫病毒LAMP-TaqMan檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201910753231.2
• 申請日: 2019-08-15
• 公開（公告）號: CN110305988A
• 公開（公告）日: 2019-10-08
• 發明（設計）人: 崔尚金;梁琳;梁瑞英;賈亞雄;陳余
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 陳征

本發明提供了鴿新城疫病毒LAMP?TaqMan檢測試劑盒。本發明以鴿新城疫病毒NDV F基因為靶基因，將環介導等溫擴增技術的高特異性、高敏感性、簡便、成本低的優勢與TaqMan探針相結合，建立鴿新城疫病毒LAMP?TaqMan的檢測方法，基于該檢測方法構建了鴿新城疫病毒LAMP?TaqMan檢測試劑盒。本發明的檢測試劑盒含有6條特異性引物和1條TaqMan熒光探針，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1?7所示。本發明試劑盒可將濃度為10拷貝/μl的標準質粒有效檢出，反應時間僅為25min。結果證實本發明試劑盒可實現快速、準確的檢測鴿新城疫病毒的目的，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明涉及PCR檢測技術領域，具體地說，涉及一種鴿新城疫病毒LAMP-TaqMan檢測試劑盒。

背景技術

鴿新城疫(Newcastle disease，ND)又被稱為鴿瘟，是由新城疫病毒(Newcastledisease Virus，NDV)變異株鴿I型副粘病毒(Pigeon Paramyxovirus Type 1，PPMV-1)引起的一種急性傳染病，該病是危害養鴿業的主要疾病之一，給養鴿業造成很大的經濟損失。目前鴿新城疫的的檢測方法有病毒分離培養、血凝試驗(HA)、血凝抑制(HI)試驗、熒光抗體檢測和普通PCR。應用這些檢測方法鴿新城疫病毒進行檢測，不僅對儀器及實驗室環境要求較高，并且操作過程復雜，對操作人員技術要求嚴格，檢測時間較長。

因此，迫切需要建立快速、簡便、特異性高的檢測鴿新城疫病毒的技術，以滿足檢測的需求，建立一種靈敏度高、準確性高的快速篩查的檢測方法成為當務之急。

環介導恒溫擴增技術(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是2000年由日本學者Notomi開發的一門新興的基因擴增技術，具有特異性強、靈敏性高、等溫高效、操作簡便、成本低廉等優點。但由于LAMP擴增是鏈置換合成，靶序列長度在300bp以內，大于500bp則較難擴增，故不能進行長鏈DNA的擴增。由于靈敏度高，極易受到污染而產生假陽性結果，因此特別注意嚴謹操作，來防范非特異性擴增與污染。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種基于LAMP和TaqMan技術的鴿新城疫病毒LAMP-TaqMan檢測試劑盒及檢測方法。

本發明的試劑盒含有6條特異性引物和1條TaqMan探針，其以鴿新城疫病毒NDV F基因為靶基因，所述靶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述6條特異性引物分別為兩條外引物，兩條內引物、兩條環引物。

所述兩條外引物為：

NVDF2F3：5’-TCATTAATAGGCAGTGGCT-3’

NVDF2B3：5’-TGTACAGTATAGATCCtGATC-3’；

兩條內引物為：

NVDF2FIP：5’-AGGTTCCCGACTGAGGGTACTGTATGACTCACAGACTC-3’

NVDF2BIP：5’-TTGCCTCAGCACTTGTCCGGTGTCAAGTTCTTCTATCAC-3’；

兩條環引物為：

NVDF2LoopF：5’-AATTTACCTGGATGCCCAAG-3’

NVDF2LoopB：5’-CGAAGGTAGTGACACAAGTC-3’。

所述1條TaqMan探針為：

5’-GTGCCACCTACCTGGAAACTTTATCTGTAAGCACAA-3’。