[發(fā)明專利]一種適用于貝類軟體動(dòng)物卵的外源物質(zhì)導(dǎo)入方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910745401.2
• 申請(qǐng)日: 2019-08-13
• 公開（公告）號(hào): CN110396526B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 連姍姍;包振民;王師;胡曉麗;趙亮;楊祖晶;朱曉梅;汪星磊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/89
• 分類號(hào): C12N15/89
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發(fā)明公開了一種適用于貝類軟體動(dòng)物卵的外源物質(zhì)導(dǎo)入方法，包括：制備液體凝膠、制備細(xì)胞載具、拉針、細(xì)胞排布、注射針預(yù)處理及顯微注射。利用該方法可將外源基因或蛋白導(dǎo)入卵細(xì)胞中，提高了外源物質(zhì)的導(dǎo)入陽性率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說是涉及一種適用于貝類軟體動(dòng)物卵的外源物質(zhì)導(dǎo)入方法。

背景技術(shù)

細(xì)胞作為生物體基本的組成單元和功能單元，是顯微操作常見的研究對(duì)象。20世紀(jì)70年代，DNA重組技術(shù)等基因工程試驗(yàn)手段為動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的產(chǎn)生奠定了基礎(chǔ)。近50年來，隨著模式生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的不斷深入，越來越多的新方法被發(fā)明出來，例如顯微注射法、電穿孔技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)、精子載體法、體細(xì)胞核移植法等。

我國已跨越進(jìn)入海洋生物基因組領(lǐng)域的國際前沿，然而，以基因編輯技術(shù)為核心的功能基因驗(yàn)證技術(shù)是制約后基因組時(shí)代深度開發(fā)和利用海洋生物基因資源的瓶頸。目前的貝類轉(zhuǎn)基因研究中，利用化學(xué)或物理方法將外源基因?qū)爰?xì)胞的方法：如電穿孔、精子載體法等，多存在轉(zhuǎn)染效率較低的問題。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物，特別是人和小鼠的細(xì)胞，但由于缺乏合適的病毒介導(dǎo)外源基因?qū)胴愵惖群Ｑ笊锛?xì)胞，制約了這一方法海洋生物基因編輯研究領(lǐng)域的應(yīng)用。體細(xì)胞核移植法首先需要將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到體外培育的體細(xì)胞中，然而，貝類的體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一直未取得明顯突破，因而無法進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞的培養(yǎng)及篩選，且該技術(shù)操作程序復(fù)雜，對(duì)設(shè)備及技術(shù)要求較高，不適用于高繁殖力的貝類軟體動(dòng)物。

在顯微鏡視野內(nèi)利用微注射針將外源物質(zhì)引入單個(gè)細(xì)胞的顯微注射技術(shù)已成為現(xiàn)代生物細(xì)胞工程及發(fā)育生物學(xué)研究的重要試驗(yàn)技術(shù)手段之一，尤其是轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域。與其他轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，顯微注射技術(shù)具備注射樣品多樣化，注射微量且定量、高效穩(wěn)定、注射基因大小不受限制、無需載體等優(yōu)點(diǎn)，在物種改良、細(xì)胞內(nèi)核質(zhì)研究及免疫學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。因此，顯微注射技術(shù)的廣適用性使其有望成為海洋生物細(xì)胞工程及基因功能研究領(lǐng)域的重要工具。然而，由于雙殼貝類等海洋生物卵細(xì)胞較小，多在微米級(jí)別，這也為研究者帶來了一定的挑戰(zhàn)，例如細(xì)胞載具的制備，注射針的硬度及拉制參數(shù)的選定等。

因此，如何提供一種適宜的顯微注射方法并以此提高貝類軟體動(dòng)物卵的外源物質(zhì)導(dǎo)入效率是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種規(guī)范化、操作簡單且高效穩(wěn)定的適用于貝類軟體動(dòng)物卵的外源物質(zhì)導(dǎo)入方法，利用顯微注射的方法，將外源物質(zhì)導(dǎo)入卵細(xì)胞中，提高了外源基因的陽性率。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種適用于貝類軟體動(dòng)物卵的外源物質(zhì)導(dǎo)入方法，包括下述步驟：

1)制備液體凝膠；

2)制備細(xì)胞載具：取潔凈的蓋玻片，先以具備與卵徑相匹配直徑的金屬絲沿其寬度方向纏繞5圈，再將纏繞金屬絲的蓋玻片輕覆于步驟1)中的液體凝膠表面，使液體凝膠浸沒蓋玻片底面，待液體凝膠凝固后，將纏繞金屬絲的蓋玻片取下，得到細(xì)胞載具，備用；

3)拉針：對(duì)排布針及注射針進(jìn)行系統(tǒng)拉針；

4)細(xì)胞排布：先將步驟3)所得排布針的針尖切除4-5mm，再以切除針尖后的排布針將卵細(xì)胞均勻排布于細(xì)胞載具內(nèi)，并以海水覆蓋整個(gè)細(xì)胞載具；

5)注射針預(yù)處理：先向注射針內(nèi)加入外源基因溶液；然后切除注射針針尖20μm，備用；

6)顯微注射：將細(xì)胞載具置于倒置顯微鏡載物臺(tái)上，調(diào)節(jié)注射針與注射針操作臂的夾角，直至注射針與細(xì)胞載具所在平面的夾角呈30°，然后以微量顯微注射儀對(duì)卵細(xì)胞進(jìn)行顯微注射。

以上技術(shù)方案達(dá)到的技術(shù)效果是：通過制備細(xì)胞載具、拉針、細(xì)胞排布及顯微注射的一系列過程，顯著提高了外源基因的導(dǎo)入率。

作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟1)中液體凝膠的制備過程如下：