[發明專利]一種適用于貝類軟體動物卵的外源物質導入方法

有效

• 申請號: 201910745401.2
• 申請日: 2019-08-13
• 公開（公告）號: CN110396526B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 連姍姍;包振民;王師;胡曉麗;趙亮;楊祖晶;朱曉梅;汪星磊
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

1.一種適用于貝類軟體動物卵的外源物質導入方法，其特征在于，包括下述步驟：

1)制備液體凝膠；

2)制備細胞載具：取潔凈的蓋玻片，先以具備與卵徑相匹配直徑的金屬絲沿其寬度方向纏繞5圈，再將纏繞金屬絲的蓋玻片輕覆于步驟1)中的液體凝膠表面，使液體凝膠浸沒蓋玻片底面；待液體凝膠凝固后，將纏繞金屬絲的蓋玻片取下，得到具有多個凹槽的細胞載具，備用；

3)拉針：對排布針及注射針進行系統拉針；具體為將普通玻璃制排布針安裝到拉針儀上，設置拉針儀的參數為：Heater650，Pull70，Vel65，TIME250，拉針的過程如下：將石英制注射針安裝到拉針儀上，設置拉針儀的參數為：Heater650，FIL4，Pull200，Vel50，Del150，LINE1，PROG90；

4)細胞排布：先將步驟3)所得排布針的針尖切除4-5mm，再以切除針尖后的排布針將卵細胞均勻排布于細胞載具內，并以海水覆蓋整個細胞載具；

5)注射針預處理：先向注射針內加入外源物質溶液；然后切除注射針針尖20μm，切除后，切口內徑2-3μm，備用；

6)顯微注射：將細胞載具置于倒置顯微鏡載物臺上，調節注射針與注射針操作臂的夾角，直至注射針與細胞載具所在平面的夾角呈30°，然后以微量顯微注射儀對卵細胞進行顯微注射；對卵細胞進行注射時，設置注射時間為500ms，補償壓力pc為50，在10倍或20倍鏡視野下進行自動化微量注射；所述石英制注射針的內徑為0.7mm。

2.根據權利要求1所述的一種適用于貝類軟體動物卵的外源物質導入方法，其特征在于，步驟1)中液體凝膠的制備過程如下：(11)將海水抽濾、滅菌，得到滅菌海水，備用；

(12)向步驟(11)得到的滅菌海水中加入滅菌海水體積10％的蒸餾水及滅菌海水質量1％的瓊脂糖，得到混合體系；

(13)對步驟(12)所得混合體系進行加熱，得到混合溶液；將混合溶液倒入培養皿中，搖勻，得到液體凝膠。

3.根據權利要求1所述的一種適用于貝類軟體動物卵的外源物質導入方法，其特征在于，步驟4)中每個凹槽內卵細胞的個數為100-200個。