[發明專利]一種短須裂腹魚銅鋅超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其應用

在審

• 申請號: 201910744077.2
• 申請日: 2019-08-13
• 公開（公告）號: CN110295184A
• 公開（公告）日: 2019-10-01
• 發明（設計）人: 王崇;梁銀銓
• 申請（專利權）人: 水利部中國科學院水工程生態研究所
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

本發明屬于生物基因工程技術領域，尤其涉及一種短須裂腹魚銅鋅超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其應用。本發明從短須裂腹魚的肝臟提取總RNA，反轉錄得到cDNA第一條鏈，采用RACE擴增法進行超氧化物歧化酶基因5'?和3'?序列的克隆，利用軟件對克隆得到的中間序列、5'?和3'?序列進行拼接成為Cu/Zn?SOD cDNA全長序列。該序列共801bp，包括完全開放閱讀框465bp，5'?UTR為60bp，3'?UTR為276bp。本發明首次公開了短須裂腹魚超氧化物歧化酶基因全序列及其全序列的克隆方法。同時，為深入研究短須裂腹魚的超氧化物歧化酶的抗氧化分子機理提供理論依據。

技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，尤其涉及一種短須裂腹魚銅鋅超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其應用。

背景技術

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD,EC1.15.1.1)是廣泛存在于生物體的重要抗氧化酶之一，能夠催化超氧陰離子自由基發生歧化反應生成過氧化氫和水，平衡機體氧自由基水平，避免活性氧簇(ROS)的毒害作用，Cu/Zn-SOD是最早被發現的超氧化物歧化酶，約占SOD總量的90％，主要存在于真核細胞的細胞漿內。當水生動物受到脅迫時，其體內產生氧化應激，并誘導ROS水平明顯增加，并進一步引起水生生物體內抗氧化酶的酶活力或基因表達的變化。SOD與其它抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、過氧化氫酶(CAT)在魚體抗氧化過程中起重要作用，其基因表達水平或酶活力變化可反映機體的氧化損傷狀況或受環境脅迫的狀態。

短須裂腹魚(Schizothorax wangchiachii)隸屬于鯉形目、鯉科、裂腹魚亞科、裂腹魚屬，主要分布于金沙江、烏江和雅礱江；因過度捕撈、環境污染、水電開發等原因，野生短須裂腹魚資源越來越少。目前已經開展人工養殖，由于養殖過程中養殖密度過高、水質條件(氨氮等)不合理，營養素(蛋白質、脂肪、微量元素)的不足或過剩都會影響魚類的生長和健康。

超氧化物歧化酶作為衡量魚類氧化損傷狀況或受環境脅迫的狀態的指標，是研究短須裂腹魚生長及抗氧化性能的一種最重要的蛋白酶。但是，目前還沒有關于短須裂腹魚的超氧化物歧化酶基因的結構和表達的報道，這極大地限制了對短須裂腹魚抗氧化防御研究的發展。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種短須裂腹魚銅鋅超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其應用。

本發明是這樣實現的，一種短須裂腹魚銅鋅超氧化物歧化酶基因，其序列見SEQID NO.11。

進一步，所述基因序列共801bp，包括完全開放閱讀框465bp，5'端非編碼區為60bp，3'端非編碼區為276bp。

進一步，所述基因序列推導編碼的氨基酸序列見SEQ ID NO.12。

如上述的一種短須裂腹魚銅鋅超氧化物歧化酶基因的克隆方法，包括以下步驟：

步驟1：提取總RNA并逆轉錄為cDNA；

步驟2：根據已知的多種動物Cu/Zn-SOD基因的保守區序列設計引物，PCR克隆Cu/Zn-SOD基因中間片段；

步驟3：獲取目標基因5’端序列；

步驟4：獲取目標基因3’端序列；

步驟5：將步驟2、步驟3和步驟4獲得的序列片段進行拼接，獲得全長序列。

進一步，步驟2中根據已知的多種動物Cu/Zn-SOD基因的保守區序列設計的引物序列見SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

進一步，步驟3中涉及的引物序列見SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6。

進一步，步驟4中涉及的引物序列見SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.9。