[發(fā)明專利]人體液中抗GABABR自身抗體的檢測材料、制備方法及應用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910738547.4 | 申請日： | 2019-08-12 |
| 公開（公告）號： | CN110606888B | 公開（公告）日： | 2021-08-31 |
| 發(fā)明（設計）人： | 閆亞平;黎培;李科 | 申請（專利權(quán)）人： | 陜西脈元生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C07K14/705 | 分類號： | C07K14/705;C07K1/14;C12N15/867;G01N33/531;G01N33/564 |
| 代理公司： | 西安恒泰知識產(chǎn)權(quán)代理事務所 61216 | 代理人： | 李婷;金艷婷 |
| 地址： | 710003 陜西省西安*** | 國省代碼： | 陜西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 人體 液中抗 gababr 自身抗體 檢測 材料 制備 方法 應用 | ||
本發(fā)明公開了人體液中抗GABABR自身抗體的檢測材料、制備方法及應用，本發(fā)明將GABABR抗原包被于NC膜上制成抗GABABR受體檢測材料，人血清和腦脊液中的特異性GABABR抗體會與抗原結(jié)合，利用堿性磷酸酶底物?配體反應進行顯色，并在顯色反應中加入本發(fā)明的封閉材料，可用通過肉眼觀察直接判斷檢測樣品中是否含有GABABR抗體。該方法具有靈敏度高，操作簡便，快速檢測等優(yōu)點，有助于抗GABABR受體腦炎的識別和診斷。
技術領域
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種人體液中抗GABABR自身抗體的檢測材料、制備方法及應用。
背景技術
抗γ-氨基丁酸B型受體(gamma-aminobutyric acid receptor，GABABR)腦炎，屬于神經(jīng)免疫性腦炎，多數(shù)以癲癇為首發(fā)癥狀和記憶紊亂、精神癥等邊緣性腦炎癥狀，約50％的患者體內(nèi)產(chǎn)生副腫瘤贅生物，多與小細胞肺癌有關，且預后不良。抗GABABR腦炎最早于2010年由Lancaster等報道，該研究利用免疫沉淀和免疫印跡的方法，于410位疑似副腫瘤相關腦炎或自免腦炎患者血液或腦脊液中檢出15例患者含抗GABABR抗體。Romana等人利用免疫印跡和免疫熒光的方法，于9422例疑似自免腦炎患者和其他相關癥狀患者血液或腦脊液中檢出20例含GABABR抗體，且從患者表現(xiàn)出癥狀到診斷花費時長大約4周左右。繼抗GABABR自身抗體發(fā)現(xiàn)后，在病因?qū)W方面可與病毒性腦炎區(qū)分開。抗GABABR抗體的檢測在腦脊液中的檢出率高于血清，且免疫抑制療法為有效的治療方法。故早期抗-GABABR IgG的識別對這類疾病的診斷和這類患者的治療、預后有很大價值。
目前常用的檢測手段有免疫熒光、ELISA、免疫印跡、免疫組化等方法，這些方法普遍存在檢測過程耗時較長，步驟繁瑣，抗體需求量大，成本高，靈敏度不高等缺點，利用這些方法很難一次性對大批量樣本同時檢測或針對某一個樣本進行反復檢測。
發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種對GABABR自身抗體進行檢測的檢測材料、該材料的制備方法及應用，解決現(xiàn)有的檢測方法檢測耗時長、步驟繁瑣、抗體需求量大、成本高、靈敏度低等問題。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案予以實現(xiàn)：
人體液中抗GABABR自身抗體的檢測材料的制備方法，包括以下步驟：
步驟1，獲取GABABR的CDS序列作為目的基因，將帶有酶切位點的目的基因插入17T2A質(zhì)粒載體中，得到重組質(zhì)粒載體17T2A-GABABR；
其中，17T2A質(zhì)粒載體包括含氨芐青霉素抗性基因AmpR序列、原核復制子pUC Ori序列、病毒復制子SV4 0O ri序列、RSV啟動子、慢病毒5’LTR、慢病毒3’LTR、Gag順式元件、RRE順式元件、env順式元件、cPPT順式元件、eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件、CMV啟動子、MCS多克隆位點以及T2A元件；
步驟2，將重組質(zhì)粒載體17T2A-GABABR轉(zhuǎn)染入293T細胞中，得到17T2A-GABABR-293T細胞；
步驟3，裂解17T2A-GABABR-293T細胞，去除17T2A-GABABR-293T細胞的核蛋白、DNA和胞漿蛋白，再加入復合提取液，4℃靜置15～30min后在35～40℃水浴，直至出現(xiàn)分層；
其中，復合提取液為Triton X100、CHAPS、N-甲基葡糖胺按照體積比為1:1:1的比例混合或洋地黃皂苷、Triton X100、NP40、CHAPS按照體積比1:1～2：1～2：1的比例混合；
步驟4：取分層后的沉淀，向沉淀中加入混合液混勻后離心，取上清液，在上清液中加入重懸液和BSA混勻，將所得上清液固化在載體膜上，得到人體液中抗GABABR自身抗體的檢測材料；
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