[發明專利]人體液中抗GABABR自身抗體的檢測材料、制備方法及應用

有效

• 申請號: 201910738547.4
• 申請日: 2019-08-12
• 公開（公告）號: CN110606888B
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 閆亞平;黎培;李科
• 申請（專利權）人: 陜西脈元生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/705
• 分類號: C07K14/705;C07K1/14;C12N15/867;G01N33/531;G01N33/564
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 李婷;金艷婷

1.一種人體液中抗GABABR自身抗體檢測材料，其特征在于，包括樣品檢測材料和樣品封閉材料，

所述的樣品檢測材料通過以下制備方法制備獲得：

步驟1，獲取GABABR的CDS序列作為目的基因，將帶有酶切位點的目的基因插入17T2A質粒載體中，得到重組質粒載體17T2A-GABABR；

其中，17T2A質粒載體包括含氨芐青霉素抗性基因AmpR序列、原核復制子pUC Ori序列、病毒復制子 SV4 0O ri序列、RSV啟動子、慢病毒5’LTR、慢病毒3’LTR、Gag順式元件、RRE順式元件、env順式元件、cPPT順式元件、eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件、CMV啟動子、MCS多克隆位點以及T2A元件；

具體包括以下步驟：

步驟1.1：通過人工合成或者PCR方法獲得GABABR的CDS序列作為目的基因，在目的基因兩端加設SalI/NotI的酶切位點；

步驟1.2：將帶有酶切位點的目的基因插入17T2A質粒載體中，插入位點為SalI/NotI，得到重組質粒，將該重組質粒命名為17T2A-GABABR；

步驟1.3：對重組質粒17T2A-GABABR進行測序，將測序正確的帶有目的基因的菌種擴大培養后進行質粒提取，得到重組質粒載體17T2A-GABABR；

步驟2，將重組質粒載體17T2A-GABABR轉染入293T細胞中，得到17T2A-GABABR-293T細胞；

步驟3，裂解17T2A-GABABR-293T細胞，去除17T2A-GABABR-293T細胞的核蛋白、DNA和胞漿蛋白，再加入復合提取液，4℃靜置15~30min后在35~40℃水浴，直至出現分層；具體包括：

棄細胞培養液，用0.85% NaCl清洗細胞1~2次，加入1ml裂解液，所述裂解液由0.85%NaCl、10mM Tris-HCl、1mM EDTA、1×PI組成；

用細胞刮板刮下GABABR細胞，收集細胞至2mL EP管中，針頭吹打10次，500g，4℃，3min，收集上清至新的2mL EP管中；

上清中加入復合提取液，4℃靜置15~30min后在37℃水浴，直至出現分層；

所述復合提取液為Triton X100、CHAPS、N-甲基葡糖胺按照體積比為1:1:1的比例混合或洋地黃皂苷、Triton X100、NP40、CHAPS按照體積比1:1~2：1~2：1的比例混合；

步驟4，取分層后沉淀，在冰水環境中靜置，向沉淀中加入10%PEG的無水乙醇混勻；4℃靜置3min，去除上清液，得到沉淀，在沉淀中加入體積重懸液，使其溶解，旋渦混勻后加入10%的甘油，-20℃保存，備用；

所述體積重懸液由10mM Tris-HCl、0.05% NP40和2×PI混合而成；

取0.8μL稀釋至合適濃度的上述膜蛋白-細胞膜復合物，使用移液槍以圓形印記將其點在載體膜上，于37℃烘箱中烘烤10 min，得到人體液中抗GABABR自身抗體的檢測材料，于4℃密封保存；

所述的樣品封閉材料的使用過程為：

將待檢測樣品和樣品封閉材料混合后孵育，孵育后加入到樣品檢測材料中再次孵育，洗滌，加入AP標記羊抗人IgG二抗孵育后進行底物顯色。

2.如權利要求1所述的人體液中抗GABABR自身抗體檢測材料，其特征在于，所述的步驟2中使用PEI轉染方法、lipofectamin2000、lipofectamin3000、lipA或電轉法將17T2A-GABABR轉染入293T細胞中，其中，電轉條件為1500V~2000V、25μF、200Ω。

3.如權利要求1所述的人體液中抗GABABR自身抗體檢測材料，其特征在于，所述的載體膜為硝酸纖維素膜、PVDF膜、尼龍膜、具有蛋白吸附能力的玻片、塑料材質的細胞培養皿或培養板。