[發(fā)明專利]人體液中抗CASPR2自身抗體的檢測(cè)材料、制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910738486.1
• 申請(qǐng)日: 2019-08-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110606886B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 閆亞平;李怡婷;馮昆;李科
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 陜西脈元生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/705
• 分類號(hào): C07K14/705;C07K1/14;C12N15/867;G01N33/531;G01N33/564
• 代理公司: 西安恒泰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 61216
• 代理人: 李婷;金艷婷

1.人體液中抗CASPR2自身抗體的檢測(cè)材料，其特征在于，包括樣品封閉材料和樣品檢測(cè)材料；

所述的樣品檢測(cè)材料通過(guò)以下制備方法制備獲得：

步驟1，獲取CASPR2的CDS序列作為目的基因，將帶有酶切位點(diǎn)的目的基因插入17T2A質(zhì)粒載體中，得到重組質(zhì)粒載體17T2A-CASPR2；

其中，17T2A質(zhì)粒載體包括含氨芐青霉素抗性基因AmpR序列、原核復(fù)制子pUC Ori序列、病毒復(fù)制子SV4 0O ri序列、RSV啟動(dòng)子、慢病毒5’LTR、慢病毒3’LTR、Gag順式元件、RRE順式元件、env順式元件、cPPT順式元件、eWPRE增強(qiáng)型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件、CMV啟動(dòng)子、MCS多克隆位點(diǎn)以及T2A元件；

步驟1具體包括以下步驟：

步驟1.1：通過(guò)人工合成或者PCR方法獲得CASPR2的CDS序列作為目的基因，在目的基因兩端加設(shè)SalI/NotI的酶切位點(diǎn)；

步驟1.2：將帶有酶切位點(diǎn)的目的基因插入17T2A質(zhì)粒載體中，插入位點(diǎn)為SalI/NotI，得到重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒命名為17T2A-CASPR2；

步驟1.3：對(duì)重組質(zhì)粒17T2A-CASPR2進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的帶有目的基因的菌種擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒提取，得到重組質(zhì)粒載體17T2A-CASPR2；

步驟2，將重組質(zhì)粒載體17T2A-CASPR2轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，得到17T2A-CASPR2-293T細(xì)胞；

步驟3，將谷胱甘肽作為小分子有機(jī)配體，使用親和層析法提取17T2A-CASPR2-293T細(xì)胞中的CASPR2抗原；

步驟4，將步驟3提取得到的CASPR2抗原固化在載體膜上，得到樣品檢測(cè)材料；

所述的樣品封閉材料包括經(jīng)過(guò)處理的載體膜和固化在處理后載體膜上的17T2A-293T細(xì)胞蛋白；所述的載體膜的處理過(guò)程為：將載體膜加入蔗糖與葡萄糖按照體積摩爾濃度比為1:1比例混合的混合試劑中，在100℃烘干20-30min或者37℃烘干8～16h；

所述的樣品封閉材料的使用過(guò)程為：將待檢測(cè)樣品和樣品封閉材料混合后孵育，孵育后加入到樣品檢測(cè)材料中再次孵育，洗滌，加入AP標(biāo)記羊抗人IgG二抗孵育后進(jìn)行底物顯色。

2.如權(quán)利要求1所述的人體液中抗CASPR2自身抗體的檢測(cè)材料，其特征在于，所述的步驟2中使用PEI轉(zhuǎn)染方法、lipofectamin2000、lipofectamin3000、lipA或電轉(zhuǎn)法將17T2A-CASPR2轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，其中，電轉(zhuǎn)條件為1500V～2000V、25μF、200Ω。

3.如權(quán)利要求1所述的人體液中抗CASPR2自身抗體的檢測(cè)材料，其特征在于，所述的載體膜為硝酸纖維素膜、PVDF膜、尼龍膜、具有蛋白吸附能力的玻片、塑料材質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板。