[發(fā)明專利]一種幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910738245.7
• 申請(qǐng)日: 2019-08-12
• 公開（公告）號(hào): CN110423799A
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳紅巖;王盛洲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 上?？剖⒅R(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發(fā)明涉及一種幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥檢測(cè)方法，屬于生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。對(duì)左氧氟沙星耐藥基因喹諾酮結(jié)合位點(diǎn)GyrA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，通過檢測(cè)反應(yīng)體系中溶解過程釋放的熒光信號(hào)曲線，根據(jù)雜交峰所顯示的Tm值區(qū)分出敏感型和耐藥型。本發(fā)明還提供了幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥耐藥檢測(cè)試劑盒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過檢測(cè)反應(yīng)體系中溶解過程釋放的熒光信號(hào)曲線，根據(jù)雜交峰所顯示的Tm值區(qū)分出敏感型和耐藥型。本發(fā)明靈敏度和特異性高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快，檢測(cè)結(jié)果差異顯著易于分型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染和慢性胃炎、胃潰瘍的疾病發(fā)生密切相關(guān)，世界衛(wèi)生組織將幽門螺桿菌定為胃癌的I類致癌原。全球約一半的人都感染幽門螺桿菌，但是僅有部分人發(fā)展為胃潰瘍，可能和幽門螺桿菌的毒力因子基因的多態(tài)性有關(guān)。目前對(duì)于幽門螺桿菌的治療以抗生素為主，比如克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、四環(huán)素等，但是幽門螺桿菌對(duì)抗生素的耐藥性逐年增加，臨床上急需一種快速、便捷、準(zhǔn)確的耐藥檢測(cè)方法來指導(dǎo)用藥。

目前幽門螺桿菌臨床檢測(cè)的方法主要是碳14呼氣法和胃黏膜取樣培養(yǎng)法。傳統(tǒng)的藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗生素耐藥需要消耗大量時(shí)間來培養(yǎng)胃黏膜分離出的幽門螺桿菌，實(shí)驗(yàn)周期往往在2周以上，不能滿足快速檢測(cè)的需求。而且對(duì)于多種幽門螺桿菌基因型混合感染的人群來說，分離培養(yǎng)往往無法分辨出比例較小的基因型。

相比于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，幽門螺桿菌的分子檢測(cè)方法更為方便、快捷，其中最有效的方法之一是實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)。在PCR反應(yīng)擴(kuò)增出目的片段后，通過特定的帶熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針和靶序列的結(jié)合，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)在空間上會(huì)分離開足夠的距離，從而可以產(chǎn)生被檢測(cè)到的熒光信號(hào)。因?yàn)椴煌腄NA片段和探針堿基之間的結(jié)合能力不同，當(dāng)目的片段出現(xiàn)突變位點(diǎn)時(shí)熒光信號(hào)會(huì)發(fā)生變化，從而將突變型區(qū)分開來。

在臨床最常用的抗生素中，克拉霉素的耐藥檢測(cè)已有相關(guān)文獻(xiàn)和專利，但是左氧氟沙星因?yàn)槟退幫蛔冚^多以及存在同義突變，使得分子檢測(cè)較為困難，往往需要設(shè)計(jì)很多條探針才能檢測(cè)部分基因型。目前僅有一種商業(yè)上可用的分子檢測(cè)方法，使用4條探針檢測(cè)，且是根據(jù)歐洲的幽門螺桿菌菌株設(shè)計(jì)，因?yàn)楹褪澜缟掀渌貐^(qū)導(dǎo)致耐藥性的突變模式不同，不適用于其它國家。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是為了解決上述背景技術(shù)中提出的問題而提供一種幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥檢測(cè)方法。

具體而言，本發(fā)明提供一種左氧氟沙星耐藥基因喹諾酮結(jié)合位點(diǎn)GyrA的熒光定量PCR檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥檢測(cè)方法，對(duì)左氧氟沙星耐藥基因喹諾酮結(jié)合位點(diǎn)GyrA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，通過檢測(cè)反應(yīng)體系中溶解過程釋放的熒光信號(hào)曲線，根據(jù)雜交峰所顯示的Tm值區(qū)分出敏感型和耐藥型。

所述幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥檢測(cè)方法，具體可以包括以下步驟：

第一步，在喹諾酮結(jié)合位點(diǎn)GyrA基因的突變位點(diǎn)上下游，通過比對(duì)序列選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物；

第二步，根據(jù)GyrA基因的已知耐藥突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)探針；選擇合適長(zhǎng)度的探針覆蓋突變位點(diǎn)，使用軟件預(yù)測(cè)各種突變的溶解峰溫度，使得兩種敏感型的溫度明顯高于各種突變型的溫度，探針修飾的熒光和猝滅基團(tuán)分別為FAM和BHQ1；

第三步，提取待測(cè)樣本中的DNA，使用第一步中的引物、第二步中的探針，與其它RT-PCR反應(yīng)液混合，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)；