[發明專利]一種幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥檢測方法

在審

• 申請號: 201910738245.7
• 申請日: 2019-08-12
• 公開（公告）號: CN110423799A
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 陳紅巖;王盛洲
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

1.一種幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥檢測方法，其特征在于，對左氧氟沙星耐藥基因喹諾酮結合位點GyrA進行熒光定量PCR檢測，通過檢測反應體系中溶解過程釋放的熒光信號曲線，根據雜交峰所顯示的Tm值區分出敏感型和耐藥型。

2.根據權利要求1所述的一種幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

第一步，在喹諾酮結合位點GyrA基因的突變位點上下游，通過比對序列選擇保守區域設計引物；

第二步，根據GyrA基因的已知耐藥突變位點，設計探針；選擇的探針覆蓋突變位點，使用軟件預測各種突變的溶解峰溫度，使得兩種敏感型的溫度明顯高于各種突變型的溫度，探針修飾的熒光和猝滅基團分別為FAM和BHQ1；

第三步，提取待測樣本中的DNA，使用第一步中的引物、第二步中的探針，與其它RT-PCR反應液混合，進行RT-PCR檢測；

第四步，根據檢測反應結束后形成的溶解曲線雜交峰的位置，即Tm值作為判斷標準：高于54℃的為敏感型，低于54℃的為耐藥型，54℃前后均出現溶解峰的為混合型。

3.根據權利要求2所述的一種幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥檢測方法，其特征在于，第一步中，所述的引物分別為：

正向引物F：5’-ATTCCATGAGCGTGATCATAGG-3’；

反向引物R：5’-GTTATCGCCATCAATAGAGCCAAA-3’。

4.根據權利要求1所述的一種幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥檢測方法，其特征在于，第二步中，所述的探針選擇：

探針1：5’-CGATAATGCGGTTTATGATG-3’；或，

探針2：5’-CGATAATGCGGTTTATGATGC-3’。

5.根據權利要求4所述的一種幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥檢測方法，其特征在于，第二步中，所述的探針選擇：探針1：5’-CGATAATGCGGTTTATGATG-3’。

6.根據權利要求1所述的一種幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥檢測方法，其特征在于，第三步中，RT-PCR反應體系為：

1*buffer，1ul；

25mM MgSO₄，1.2ul；

2.5mM dNTPs，0.8ul；

10uM正向引物F，0.05ul；

10uM反向引物R，0.5ul；

10uM探針P，0.1ul；

TaqDNA聚合酶，0.05ul；

樣品DNA，0.4ul；

去離子水，5.9ul；共計10ul。

7.根據權利要求1所述的一種幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥檢測方法，其特征在于，第三步中，RT-PCR反應條件為：

95℃預變性5min；45個循環中，95攝氏度變性20s，57℃退火30s，72℃延伸20s；72℃徹底延伸5min；95℃變性2min，40℃探針退火雜交3min；溶解曲線從40℃-80℃，每升溫1℃記錄10次。

8.根據權利要求1所述的一種幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥檢測方法，其特征在于，第二步設計探針時，已知導致左氧氟沙星的耐藥突變類型有：A260T、A260C、C261G、C261A、C263T、G271A、G271T、A272G、A272C，不導致耐藥的同義突變為C261T。

9.一種幽門螺桿菌左氧氟沙星耐藥檢測試劑盒，其特征在于，包含RT-PCR反應液、正向引物F、反向引物R與探針，

其中，

正向引物F：5’-ATTCCATGAGCGTGATCATAGG-3’；

反向引物R：5’-GTTATCGCCATCAATAGAGCCAAA-3’；

探針選擇：

探針1：5’-CGATAATGCGGTTTATGATG-3’；或，

探針2：5’-CGATAATGCGGTTTATGATGC-3’。