[發明專利]通過抑制肌肉組織mstn基因表達獲得快長青鯽的方法

有效

• 申請號: 201910736739.1
• 申請日: 2019-08-10
• 公開（公告）號: CN110438153B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發明（設計）人: 張運生;楊品紅;劉良國
• 申請（專利權）人: 湖南文理學院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

本發明屬于基因表達技術領域，公開了一種通過抑制肌肉組織mstn基因表達獲得快長青鯽的方法，構建轉基因載體，在轉基因載體中肌肉組織特異表達啟動子和csy4系統相結合，在啟動子的下游插入靶基因的反向DNA序列；當轉基因元件整合到宿主基因組后，轉錄產生兩段和靶基因mRNA不同部位互補的RNA片段，形成的antisense?RNA/mRNA二聚體被內源性核酸酶識別并切割降解，導致靶基因mRNA水平的降低，獲得所需的某些表型或生化特征。通過實驗表明，兩段反義RNA導致實驗組mstn?mRNA水平顯著降低；分別在出膜后取樣，每次稱10條魚，取平均體重；出膜后20天對照組和實驗組，實驗組中，魚個體較為粗壯，體長和體高均顯著大于對照魚。

技術領域

本發明屬于基因表達技術領域，尤其涉及一種通過抑制肌肉組織mstn基因表達獲得快長青鯽的方法。

背景技術

目前抑制內源基因表達的技術主要有MO技術、RNAi技術和CRISPR/Cas9基因編輯技術。MO技術是一種反義技術，其原理是人工將核苷酸中的五碳糖環用一個嗎啡環代替，同時對磷酸基團也做了改變，獲得一種DNA分子類似物，這種類似物可以以堿基互補配對的方式與RNA結合，從而阻止核糖體與RNA的結合，使得基因在表達水平被阻斷。MO技術抑制效果很明顯，但是其只能通過體外合成后導入受精卵或細胞，短暫(有效期約4天)的抑制基因的表達，故多用于胚胎發育早期基因功能的研究；RNAi技術是將同源雙鏈RNA導入細胞內，抑制目的基因表達的技術，但是通過表達載體獲得siRNA時，啟動子的選擇嚴重受限，只能使用依賴RNA聚合酶III的啟動子，目前可用的只有泛表達啟動子，如人源和鼠源U6啟動子和人源H1啟動子等，且這些啟動子的活性較弱，很難得到大量的siRNA；CRISPR/Cas9基因編輯技術是目前使用最為廣泛的一種技術，可以完全沉默基因表達，但是我們選擇的目的基因，不但具有抑制肌肉生長的功能，還有促進脂肪代謝等功能，因此完全沉默可能會影響魚類脂肪代謝。反義RNA技術在轉基因載體構建上比較簡單，可以選擇依賴RNA聚合酶II啟動子(真核生物基因表達均有RNA聚合酶II的啟動子驅動)，選擇范圍比較廣，可以使用肌肉組織特異性表達的啟動子。另外，為了產生足夠的反義RNA，我們引入csy4系統，使得在啟動子活性一定的情況下，產生更多的反義RNA。綜上述所，我們選擇利用在肌肉特異表達啟動子mylz2驅動mstn反義RNA的轉錄，同時為了一定程度上增強抑制效果，我們將反義RNA技術和csy4系統相結合，同時獲得兩種不同的反義RNA的技術方案，適合于青鯽快長育種。

魚類是人類所需優質蛋白質的重要來源之一。魚類肌肉組織既是魚類的運動器官，也是人類所需的優質蛋白。魚類養殖實質上就是采用適合的養殖技術，最大限度地促進魚類肌纖維細胞的快速增殖，促使肌肉組織快速生長發育，達到增加生產效益目的。另外，提高魚類生長率，不但可以縮短上市時間，提高單位時間內的養殖產量，還可以一定程度上降低魚類發病率，從而降低養殖風險。

肌肉生長抑制素(myostatin，mstn)又稱生長分化因子8(growthanddifferentiation?factor-8,gdf-8)，在多種生物肌肉生長中起負向調節作用。例如在牛、小鼠、狗和人中，該基因功能的全部或部分喪失均會導致肌肉量的顯著增加。在斑馬魚、青鳉及虹鱒中，敲除該基因也得到相似結果。因此，mstn基因不僅是哺乳動物改良育種的靶標基因，也可能是水產養殖魚類品種改良的關鍵靶標基因。因為青鯽為洞庭湖獨有鯽種，分布范圍不廣泛，使得對青鯽的研究甚少，對青鯽研究大多限于形態學分類、生殖方式以及繁育技術等方面。青鯽中的研究較少。青鯽雖然營養價值高，但相比四大家魚，生長速度緩慢，是影響其養殖效益的主要因素，因此，提高青鯽生長速度，可以很大程度上提高青鯽養殖效益。反義RNA技術是指通過體外合成或構建人工載體在體內轉錄生成一段RNA，該RNA和內源靶基因的mRNA或pre-mRNA互補結合，從而實現在轉錄、加工成熟或翻譯水平上抑制內源基因的表達目的的一種技術。

綜上所述，現有技術存在的問題是：目前該基因在青鯽中的研究較少。

解決上述技術問題的難度：