[發(fā)明專(zhuān)利]通過(guò)抑制肌肉組織mstn基因表達(dá)獲得快長(zhǎng)青鯽的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910736739.1
• 申請(qǐng)日: 2019-08-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110438153B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張運(yùn)生;楊品紅;劉良國(guó)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖南文理學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 重慶市信立達(dá)專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

1.一種通過(guò)抑制肌肉組織mstn基因表達(dá)獲得快長(zhǎng)青鯽的方法，其特征在于，所述通過(guò)抑制肌肉組織mstn基因表達(dá)獲得快長(zhǎng)青鯽的方法包括以下步驟：

第一步，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體，在轉(zhuǎn)基因載體中的啟動(dòng)子下游插入靶基因的反向DNA序列；

第二步，將反義RNA技術(shù)和csy4系統(tǒng)相結(jié)合，使之一次產(chǎn)生2種不同的反義RNA，同時(shí)作用于目的基因；當(dāng)轉(zhuǎn)基因元件整合到宿主基因組后，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生兩段和靶基因mRNA不同部位互補(bǔ)的RNA片段，形成的antisense-RNA/mRNA二聚體被內(nèi)源性核酸酶識(shí)別并切割降解導(dǎo)致靶基因mRNA水平的降低，獲得所需的表型或生化特征；

所述通過(guò)抑制肌肉組織mstn基因表達(dá)獲得快長(zhǎng)青鯽的方法還包括青鯽mstn基因部分序列克隆，包括：提取青鯽肌肉組織總RNA、反轉(zhuǎn)錄為cDNA、以cDNA為模板，引物為：SEQ?IDNO：1和SEQ?ID?NO：2；

識(shí)別后能從識(shí)別序列下游將RNA切斷，序列轉(zhuǎn)錄后，轉(zhuǎn)錄表達(dá)出CSY4蛋白，并將RNA切成3段，其中csy4RNA被降解，另外兩段RNA則為mstn基因的反義RNA序列，反義RNA序列和mstnmRNA互補(bǔ)結(jié)合形成部分雙鏈，導(dǎo)致降解，同時(shí)阻止轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進(jìn)行；

經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后獲得序列SEQ?ID?NO：3；

含有反義mstn基因載體的序列為SEQ?ID?NO：4。

2.如權(quán)利要求1所述的通過(guò)抑制肌肉組織mstn基因表達(dá)獲得快長(zhǎng)青鯽的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)基因載體為含有肌肉組織特異表達(dá)mylz2啟動(dòng)子質(zhì)粒載體，通過(guò)BamHI和NotI酶切，目的基因片段插入其中，形成轉(zhuǎn)基因載體，含有主要的元件為T(mén)ol2-mylz2-csy4-csy4s-as/mstn-csy4s-as/mstn-PolyA-Tol2。

3.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述通過(guò)抑制肌肉組織mstn基因表達(dá)獲得快長(zhǎng)青鯽的方法的轉(zhuǎn)基因魚(yú)家系建立方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因魚(yú)家系建立方法包括：

(1)在顯微注射前，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因載體處理，包括去毒性處理和防串聯(lián)處理；

(2)體外合成Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA；

(3)對(duì)青鯽胚胎顯微注射所述轉(zhuǎn)基因載體處理后的質(zhì)粒DNA和所述Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA；

(4)將顯微注射后的青鯽胚胎作為P0代，所述P0代養(yǎng)殖性成熟后，通過(guò)與野生雌魚(yú)測(cè)交得到后代F1代，將所述F1代陽(yáng)性個(gè)體飼養(yǎng)至性成熟后采用自交獲得純合F2代。

4.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因魚(yú)家系建立方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因魚(yú)家系建立方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因魚(yú)家系建立方法具體方法如下：

首先，將帶有轉(zhuǎn)座酶基因的396載體，用NotⅠ限制性?xún)?nèi)切酶線(xiàn)性化，然后用SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；

其次，進(jìn)行DNA模板的去除及反應(yīng)終止；

最后，純化。