[發(fā)明專利]一種性腺組織中特異高表達基因增加雄魚繁殖力的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910736721.1
• 申請日: 2019-08-10
• 公開（公告）號: CN110396518A
• 公開（公告）日: 2019-11-01
• 發(fā)明（設計）人: 張運生;劉良國;楊品紅
• 申請（專利權）人: 湖南文理學院
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;A01K67/027
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

本發(fā)明屬于基因表達技術領域，公開了一種性腺組織中特異高表達基因增加雄魚繁殖力的方法，提取性腺組織RNA?反轉錄為cDNA，cDNA為模板，tesk1?F/tesk1?R為引物，高保真酶pfu進行PCR擴增；所用載體為含有kop啟動子和nanos 3’UTR的質粒載體，kop啟動子和nanos3’UTR能將目的基因在生殖細胞中特異表達，通過NcoI和BseAI酶切，將tesk1基因插入kop啟動子和nanos3’UTR之間，形成轉基因載體；顯微注射獲得轉基因魚。本發(fā)明在雄魚性腺組織中特異高表達tesk1基因，發(fā)現(xiàn)可以顯著性增加雄魚的性腺指數(shù)，增加其產(chǎn)精量，實現(xiàn)了提高雄性斑馬魚生殖能力的目的。

技術領域

本發(fā)明屬于基因表達技術領域，尤其涉及一種性腺組織中特異高表達基因增加雄魚繁殖力的方法。

背景技術

目前，最接近的現(xiàn)有技術：一種魚類繁殖能力大小直接決定了其應用推廣的程度。目前大規(guī)模商品化養(yǎng)殖的四大家魚，之所以能夠全國大規(guī)模推廣養(yǎng)殖，主要原因之一是能夠實現(xiàn)大規(guī)模人工繁殖，獲得大量的苗種。但是，對于黃鱔、石斑魚等一些名特優(yōu)魚類，推廣養(yǎng)殖的最大瓶頸就是繁殖能力較差，不能獲得大量的苗種，也使得這些魚類價格常年居高不下。因此，提高魚類的繁殖力，對于一些魚類的進一步推廣具有非常重要的意義。對于雄性明顯少于雌性的魚類，例如青鯽及雌雄同體的石斑魚等，提高雄性個體繁殖力，可以一定程度上緩解雄性個體稀少的問題，有利于進一步促進其推廣養(yǎng)殖。目前，解決一些魚類繁殖力弱的問題大多采用調控影響魚類性腺發(fā)育的外部生態(tài)條件，如營養(yǎng)、水溫、光照、水流及溶氧等，這些操作一定程度上增加了魚類的繁殖力，但是由于影響因素太多，操作復雜，增加了養(yǎng)殖成本，且對于室外養(yǎng)殖可重復性較小。另外，近年來，“借腹懷胎”為魚類生殖相關研究中的熱點，但是，目前該技術仍處于理論階段，尚沒有推廣使用。在此背景下，通過轉基因的方法增加雄魚生殖力，通過建立家系，可以使生殖力增強的性狀代代相傳，可以做到一蹴而就。

魚類是人類賴以生存優(yōu)質蛋白的重要來源之一，是最后的野生食物源。魚類中含有人體必需的8種氨基酸，不飽和脂肪酸等，營養(yǎng)價值豐富，而且?guī)缀醪淮嬖谌唆~共患的疾病，因此備受青睞。漁業(yè)的可持續(xù)發(fā)展已經(jīng)成為當今世界各國關注的主題。這種情況下，水產(chǎn)養(yǎng)殖被認為是滿足人類不斷增長的對水產(chǎn)動物蛋白需求的唯一途徑。具有優(yōu)良性狀的養(yǎng)殖魚類新品種是未來水產(chǎn)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的關鍵之一。人工選育、引種和雜交育種是獲得具有優(yōu)良性狀的養(yǎng)殖魚類新品種的傳統(tǒng)方法，但是傳統(tǒng)育種方法超長的育種年限極大的限制了魚類育種業(yè)的發(fā)展。轉基因技術可在短時間內即可獲得具有優(yōu)良性狀的新品種。

相比于哺乳動物，魚類具有體外受精，體外發(fā)育，懷卵量大，且易于轉基因操作，胚胎經(jīng)轉基因操作后不需要放回母體培育等優(yōu)勢，這些優(yōu)勢使轉基因技術能夠迅速應用于魚類育種。轉基因技術應用于魚類育種的首次探索開始于20世紀80年代，朱作言等利用小鼠金屬硫基因啟動子成功驅動人的生長激素基因在鯽魚中表達，培育出世界上第一批快速生長的轉基因魚。之后，轉基因技術應用于魚類育種中并迅速展開，經(jīng)過30多年的發(fā)展，目前通過轉基因操作獲得具有生長速度快、餌料利用率高、抗病抗逆強等優(yōu)良性狀的轉基因魚類近40種，而且?guī)缀醢ㄊ澜缟纤械闹匾B(yǎng)殖魚類。

一個新的魚類品種的大規(guī)模推廣養(yǎng)殖的前提是能夠進行人工繁殖，獲得大量苗種。但是，目前一些魚類雌雄比例嚴重失調，雄魚個體非常少，如石斑魚、青鯽等，這些魚類雖然具有諸多優(yōu)良性狀，但是由于缺少雄性個體，其繁殖規(guī)模受到嚴重限制，阻止了其進一步推廣養(yǎng)殖。但是，目前仍然沒有針對增加雄魚生殖能力的轉基因研究。目前關于轉基因魚的研究主要對象為產(chǎn)量較大的魚類，如四大家魚及鯉魚等，目的是提高這些魚類的生長速度、抗病、抗寒能力等。但是對這些魚類而言，生殖能力很強，不需要增加繁殖能力。但是，目前我國漁業(yè)發(fā)展的重點是經(jīng)濟效益好的特種水產(chǎn)魚類，特種水產(chǎn)魚類種類繁多，其中一些魚類推廣養(yǎng)殖的瓶頸問題，就是繁殖力差，因此，今后漁業(yè)的發(fā)展方向要求研究增加魚類繁殖力的技術。

綜上所述，現(xiàn)有技術存在的問題是：

(1)目前一些魚類雌雄比例嚴重失調，雄魚個體非常少；缺少雄性個體，其繁殖規(guī)模受到嚴重限制，阻止了其進一步推廣養(yǎng)殖。