[發明專利]一種性腺組織中特異高表達基因增加雄魚繁殖力的方法

在審

• 申請號: 201910736721.1
• 申請日: 2019-08-10
• 公開（公告）號: CN110396518A
• 公開（公告）日: 2019-11-01
• 發明（設計）人: 張運生;劉良國;楊品紅
• 申請（專利權）人: 湖南文理學院
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;A01K67/027
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

1.一種性腺組織中特異高表達基因增加雄魚繁殖力的方法，其特征在于，所述性腺組織中特異高表達基因增加雄魚繁殖力的方法包括以下步驟：

第一步，提取性腺組織RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，以tesk1-F/tesk1-R為引物，以高保真酶pfu進行PCR擴增，tesk1基因的克隆；

第二步，所用載體為含有kop啟動子和nanos 3’UTR的質粒載體，kop啟動子和nanos3’UTR能將目的基因在生殖細胞中特異表達，通過NcoI和BseAI酶切，將tesk1基因插入kop啟動子和nanos3’UTR之間，形成轉基因載體；

第三步，顯微注射獲得轉基因魚。

2.如權利要求1所述的性腺組織中特異高表達基因增加雄魚繁殖力的方法，其特征在于，所述第一步的引物為：

tesk1-F 5’-CACCCATGGGTTGCGTTAAAGTGACCCGCT-3’；

tesk1-R 5’-TTCTCCGGAGAGATGTCGCAGTGGTCGTC-3’。

3.如權利要求1所述的性腺組織中特異高表達基因增加雄魚繁殖力的方法，其特征在于，所述第二步的轉基因載體，含有主要的元件為Tol2-kop-tesk1-nanos3’UTR-Tol2。

4.如權利要求1所述的性腺組織中特異高表達基因增加雄魚繁殖力的方法，其特征在于，所述第三步的顯微注射獲得轉基因魚方法包括：

(1)在顯微注射前，進行所述轉基因載體處理，其包括去毒性處理和防串聯處理；

(2)體外合成Tol2轉座酶mRNA；

(3)對斑馬魚胚胎顯微注射所述轉基因載體處理后的質粒DNA和所述Tol2轉座酶mRNA；

(4)將顯微注射后的斑馬魚胚胎作為P0代，所述P0代養殖性成熟后，通過與野生斑馬雌魚測交得到后代F1代，將所述F1代陽性個體飼養至性成熟后采用自交獲得純合F2代。

5.如權利要求4所述的性腺組織中特異高表達基因增加雄魚繁殖力的方法，其特征在于，所述體外合成Tol2轉座酶mRNA方法包括：

首先，將帶有轉座酶基因的396載體，用Not Ⅰ限制性內切酶線性化，然后用SP6體外轉錄試劑盒進行體外轉錄；

其次，進行DNA模板的去除及反應終止；

最后，純化。