[發(fā)明專(zhuān)利]一種性腺組織中特異高表達(dá)基因增加雄魚(yú)繁殖力的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910736721.1
• 申請(qǐng)日: 2019-08-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110396518A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-11-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張運(yùn)生;劉良國(guó);楊品紅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖南文理學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/12
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/12;C12N15/63;A01K67/027
• 代理公司: 重慶市信立達(dá)專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

1.一種性腺組織中特異高表達(dá)基因增加雄魚(yú)繁殖力的方法，其特征在于，所述性腺組織中特異高表達(dá)基因增加雄魚(yú)繁殖力的方法包括以下步驟：

第一步，提取性腺組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，以tesk1-F/tesk1-R為引物，以高保真酶pfu進(jìn)行PCR擴(kuò)增，tesk1基因的克隆；

第二步，所用載體為含有kop啟動(dòng)子和nanos 3’UTR的質(zhì)粒載體，kop啟動(dòng)子和nanos3’UTR能將目的基因在生殖細(xì)胞中特異表達(dá)，通過(guò)NcoI和BseAI酶切，將tesk1基因插入kop啟動(dòng)子和nanos3’UTR之間，形成轉(zhuǎn)基因載體；

第三步，顯微注射獲得轉(zhuǎn)基因魚(yú)。

2.如權(quán)利要求1所述的性腺組織中特異高表達(dá)基因增加雄魚(yú)繁殖力的方法，其特征在于，所述第一步的引物為：

tesk1-F 5’-CACCCATGGGTTGCGTTAAAGTGACCCGCT-3’；

tesk1-R 5’-TTCTCCGGAGAGATGTCGCAGTGGTCGTC-3’。

3.如權(quán)利要求1所述的性腺組織中特異高表達(dá)基因增加雄魚(yú)繁殖力的方法，其特征在于，所述第二步的轉(zhuǎn)基因載體，含有主要的元件為T(mén)ol2-kop-tesk1-nanos3’UTR-Tol2。

4.如權(quán)利要求1所述的性腺組織中特異高表達(dá)基因增加雄魚(yú)繁殖力的方法，其特征在于，所述第三步的顯微注射獲得轉(zhuǎn)基因魚(yú)方法包括：

(1)在顯微注射前，進(jìn)行所述轉(zhuǎn)基因載體處理，其包括去毒性處理和防串聯(lián)處理；

(2)體外合成Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA；

(3)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎顯微注射所述轉(zhuǎn)基因載體處理后的質(zhì)粒DNA和所述Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA；

(4)將顯微注射后的斑馬魚(yú)胚胎作為P0代，所述P0代養(yǎng)殖性成熟后，通過(guò)與野生斑馬雌魚(yú)測(cè)交得到后代F1代，將所述F1代陽(yáng)性個(gè)體飼養(yǎng)至性成熟后采用自交獲得純合F2代。

5.如權(quán)利要求4所述的性腺組織中特異高表達(dá)基因增加雄魚(yú)繁殖力的方法，其特征在于，所述體外合成Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA方法包括：

首先，將帶有轉(zhuǎn)座酶基因的396載體，用Not Ⅰ限制性?xún)?nèi)切酶線性化，然后用SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；

其次，進(jìn)行DNA模板的去除及反應(yīng)終止；

最后，純化。