[發(fā)明專利]一種口腔黏膜上皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910735940.8
• 申請(qǐng)日: 2019-08-09
• 公開（公告）號(hào): CN110317777A
• 公開（公告）日: 2019-10-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦曉東;何祥一;曾颯;張志東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 北京棘龍知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11740
• 代理人: 戴麗偉

本發(fā)明公開了一種口腔黏膜上皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，具體涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體分離和培養(yǎng)步驟如下：無菌條件下取唇裂整復(fù)術(shù)中切除的多余口腔黏膜組織，用PBS反復(fù)沖洗，用眼科剪除去黏膜下組織，剪成小塊，置于DispaseⅡ酶中，4℃過夜消化18h，用眼科鑷分離上皮層，PBS液沖洗上皮層，將上皮剪切成小片加入混合消化液中，37℃消化7分鐘，加胎牛血清終止消化，用吸管反復(fù)吹打至單細(xì)胞懸液，離心棄上清，加入無血清培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)瓶中倒置培養(yǎng)，當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞匯合率達(dá)70％?80％時(shí)，用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化并以1:2傳代。本發(fā)明整個(gè)培養(yǎng)過程簡(jiǎn)單，得到的原代培養(yǎng)細(xì)胞成活率高，并且不易出現(xiàn)雙核、多核、畸形核細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種口腔黏膜上皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

大多數(shù)口腔黏膜疾病的病因復(fù)雜，致病機(jī)理不詳，為進(jìn)一步研究口腔黏膜上皮細(xì)胞(Oralmucosaepithelialcells,OMECs)多因素、多步驟致病機(jī)制，建立人永生化OMECs細(xì)胞系是非常必要的。正常情況下，OMECs在體外僅能傳代培養(yǎng)5-6代，無法滿足研究需求。

因此，有學(xué)者進(jìn)行了人永生化OMECs細(xì)胞系的探索，如HPV16E6E7誘導(dǎo)的永生化口腔粘膜上皮細(xì)胞系，但HE染色可見細(xì)胞大小不均一，出現(xiàn)雙核、多核、畸形核細(xì)胞，結(jié)果不甚理想。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明的實(shí)施例提供一種口腔黏膜上皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，采用德國Merck Millipore公司提供的Human Epidermal KeratinocyteComplete Medium Kit無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，成功分離培養(yǎng)了原代OMECs，無成纖維細(xì)胞混雜，原代細(xì)胞接種3天后即可長(zhǎng)滿，細(xì)胞形態(tài)均一，密集排列呈“鋪路石”樣生長(zhǎng)，符合上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)特征，且生長(zhǎng)迅速。證實(shí)了此培養(yǎng)基可在短期內(nèi)獲得大量具有增殖能力的OMECs，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求，整個(gè)培養(yǎng)過程簡(jiǎn)單，得到的原代培養(yǎng)細(xì)胞成活率高，并且不易出現(xiàn)雙核、多核、畸形核細(xì)胞。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種口腔黏膜上皮細(xì)胞的分離方法，具體分離步驟如下：

S101、在無菌條件下，取唇裂整復(fù)術(shù)中切除的多余口腔黏膜組織，將其放入燒杯容器內(nèi)，然后使用50ml含1％雙抗的PBS反復(fù)沖洗5遍，去除口腔黏膜組織表面的污垢和雜質(zhì)；

S102、用眼科剪除去沖洗后的黏膜下組織，然后將剩余的黏膜上組織剪成2mm×1mm的小塊，然后置于盛有2.5g/LDispaseⅡ酶的容器中，過夜消化；

S103、將步驟S102中過夜消化的黏膜組織用眼科鑷分離上皮層，再用含1％雙抗的PBS液沖洗上皮層，將口腔黏膜組織上皮層剪切成小片，然后再加入盛有混合消化液的容器中進(jìn)行消化；

S104、向步驟S103的容器中加胎牛血清終止消化，再用吸管反復(fù)吹打至單細(xì)胞懸液；

S105、將單細(xì)胞懸液取出，將其倒入離心機(jī)內(nèi)，對(duì)溶液進(jìn)行離心，得到離心基液。

在一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述步驟S101中，取多余口腔黏膜組織的唇裂整復(fù)術(shù)患者年齡為3個(gè)月。

在一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述步驟S102中，口腔黏膜上組織過夜消化的環(huán)境溫度為3-5℃，過夜消化時(shí)間為18h。

在一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述步驟S103中，混合消化液具體為0.25％胰酶和0.02％EDTA，且0.25％胰酶：0.02％EDTA＝1：1。

在一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述步驟S103中，口腔黏膜組織上皮層消化的環(huán)境溫度為36-38℃，消化時(shí)間為7分鐘。

在一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述步驟S105中，單細(xì)胞懸液在離心機(jī)800rpm的速度下離心5min。