[發(fā)明專利]一種口腔黏膜上皮細胞的分離和培養(yǎng)方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910735940.8 | 申請日： | 2019-08-09 |
| 公開（公告）號： | CN110317777A | 公開（公告）日： | 2019-10-11 |
| 發(fā)明（設計）人： | 秦曉東;何祥一;曾颯;張志東 | 申請（專利權）人： | 中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 |
| 主分類號： | C12N5/071 | 分類號： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 北京棘龍知識產(chǎn)權代理有限公司 11740 | 代理人： | 戴麗偉 |
| 地址： | 甘肅省蘭州*** | 國省代碼： | 甘肅;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 消化 口腔黏膜 上皮細胞 上皮層 胰蛋白酶 傳代 唇裂 吸管 口腔黏膜組織 無血清培養(yǎng)基 細胞培養(yǎng)技術 原代培養(yǎng)細胞 單細胞懸液 倒置培養(yǎng) 胎牛血清 無菌條件 細胞匯合 原代培養(yǎng) 剪切 吹打 核細胞 培養(yǎng)瓶 消化液 眼科剪 眼科鑷 多核 雙核 小塊 成活率 沖洗 接種 切除 畸形 | ||
1.一種口腔黏膜上皮細胞的分離，其特征在于，具體分離步驟如下：
S101、在無菌條件下，取唇裂整復術中切除的多余口腔黏膜組織，將其放入燒杯容器內，然后使用50ml含1％雙抗的PBS反復沖洗5遍，去除口腔黏膜組織表面的污垢和雜質；
S102、用眼科剪除去沖洗后的黏膜下組織，然后將剩余的黏膜上組織剪成2mm×1mm的小塊，然后置于盛有2.5g/LDispaseⅡ酶的容器中，過夜消化；
S103、將步驟S102中過夜消化的黏膜組織用眼科鑷分離上皮層，再用含1％雙抗的PBS液沖洗上皮層，將口腔黏膜組織上皮層剪切成小片，然后再加入盛有混合消化液的容器中進行消化；
S104、向步驟S103的容器中加胎牛血清終止消化，再用吸管反復吹打至單細胞懸液；
S105、將單細胞懸液取出，將其倒入離心機內，對溶液進行離心，得到離心基液。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種口腔黏膜上皮細胞的分離方法，其特征在于：所述步驟S101中，取多余口腔黏膜組織的唇裂整復術患者年齡為3個月。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種口腔黏膜上皮細胞的分離方法，其特征在于：所述步驟S102中，口腔黏膜上組織過夜消化的環(huán)境溫度為3-5℃，過夜消化時間為18h。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種口腔黏膜上皮細胞的分離方法，其特征在于：所述步驟S103中，混合消化液具體為0.25％胰酶和0.02％EDTA，且0.25％胰酶：0.02％EDTA＝1：1。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種口腔黏膜上皮細胞的分離方法，其特征在于：所述步驟S103中，口腔黏膜組織上皮層消化的環(huán)境溫度為36-38℃，消化時間為7分鐘。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種口腔黏膜上皮細胞的分離方法，其特征在于：所述步驟S105中，單細胞懸液在離心機800rpm的速度下離心5min。
7.基于權利要求1-6任意一項所述的口腔黏膜上皮細胞的分離方法的培養(yǎng)方法，其特征在于，具體培養(yǎng)步驟如下：
S201、單細胞懸液離心結束后，得到的離心基液棄上清，加入無血清培養(yǎng)基HumanEpidermalKeratinocyteCompleteMediumKit，并接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，倒置培養(yǎng)3d；
S202、當步驟S201中原代培養(yǎng)的細胞匯合率達70％-80％時，用0.25％胰蛋白酶消化，并以1：2傳代。
8.根據(jù)權利要求7所述的一種口腔黏膜上皮細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟S202中，原代培養(yǎng)的細胞還可以用0.02％EDTA進行消化。
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