[發(fā)明專利]一種雞新型環(huán)狀病毒GyV3的熒光定量PCR檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910735894.1
• 申請(qǐng)日: 2019-08-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110938707A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田雪;李玉峰;于可響;胡峰;劉存霞;黃兵;宋敏訓(xùn)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京國(guó)坤專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11491
• 代理人: 趙紅霞

本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)雞新型環(huán)狀病毒GyV3的特異性引物，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。一種雞新型環(huán)狀病毒GyV3的熒光定量PCR檢測(cè)方法：(1)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：提取待測(cè)物的基因組DNA，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；推導(dǎo)出標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程(標(biāo)準(zhǔn)曲線)；(2)結(jié)果判定：無(wú)Ct值并且無(wú)擴(kuò)增曲線，樣品判為陰性；Ct值≤36，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，樣品判為陽(yáng)性。本發(fā)明所建立的方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)GyV3安全、特異、快速、靈敏、簡(jiǎn)單的快速檢測(cè)，從而為雞新型環(huán)狀病毒GyV3的流行病學(xué)調(diào)查、早期診斷提供一種方法，具有重要的意義，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域空白。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種雞新型環(huán)狀病毒GyV3的熒光定量PCR檢測(cè)方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

雞新型環(huán)狀病毒(Gyrovirus3,GyV3)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的能引起雞腺胃炎的病原，目前，該病毒在雞群中屬于第二個(gè)被鑒定的單鏈環(huán)狀DNA病毒，第一個(gè)單鏈環(huán)狀DNA病毒是雞傳染性貧血。GyV3病毒可引起免疫抑制、貧血以及腺胃腫大等癥狀。鑒于此病毒的危害，亟需建立快速敏感的檢測(cè)方法用于早期診斷，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行有效保護(hù)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法(Real time PCR)是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系。

目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)此病毒的各種檢測(cè)方法的報(bào)道，因此本研究建立的利用SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)雞新型環(huán)狀病毒GyV3的熒光定量PCR檢測(cè)方法為目前檢測(cè)此類病毒唯一的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種雞新型環(huán)狀病毒GyV3的熒光定量PCR檢測(cè)方法，以及所涉及的特異性引物、試劑盒。本發(fā)明所建立的方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)GyV3安全、特異、快速、靈敏、簡(jiǎn)單的快速檢測(cè)，從而為雞新型環(huán)狀病毒GyV3的流行病學(xué)調(diào)查、早期診斷提供一種方法，具有重要的意義，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域空白。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種檢測(cè)雞新型環(huán)狀病毒GyV3的特異性引物，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；其所特異性擴(kuò)增的目的片段大小為125bp；

上游引物9-GyV3forward：5'-TCCAATAAGTTCGTCGGAGTC-3'(SEQ ID NO.1)；

下游引物9-GyV3reverse：5'-GCAGATCGCGTCGTGAGTA-3'(SEQ ID NO.2)。

上述引物在制備檢測(cè)雞新型環(huán)狀病毒GyV3的試劑盒中的應(yīng)用。

一種檢測(cè)雞新型環(huán)狀病毒GyV3的試劑盒，包括上述特異性引物，以及檢測(cè)所必須的試劑。

一種雞新型環(huán)狀病毒GyV3的熒光定量PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：提取待測(cè)物的基因組DNA，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述特異性引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；

進(jìn)一步地，反應(yīng)體系如下：反應(yīng)液每管20μL，含有SYBR Green I UniversalMaster Mix10μL，10pmol/μL 9-GyV3forward、9-GyV3reverse各1μL，RNase Free dH₂O 6μL，待檢測(cè)的樣品DNA模板2μL；