[發明專利]一種雞新型環狀病毒GyV3的熒光定量PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201910735894.1
• 申請日: 2019-08-09
• 公開（公告）號: CN110938707A
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發明（設計）人: 田雪;李玉峰;于可響;胡峰;劉存霞;黃兵;宋敏訓
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院家禽研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 趙紅霞

1.一種檢測雞新型環狀病毒GyV3的特異性引物，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

上游引物9-GyV3 forward：5'-TCCAATAAGTTCGTCGGAGTC-3'；

下游引物9-GyV3 reverse：5'-GCAGATCGCGTCGTGAGTA-3'。

2.權利要求1所述的特異性引物對在制備檢測雞新型環狀病毒GyV3的試劑盒中的應用。

3.一種檢測雞新型環狀病毒GyV3的試劑盒，包括權利要求1所述的特異性引物，以及檢測所必須的試劑。

4.一種雞新型環狀病毒GyV3的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)實時熒光定量PCR反應：提取待測物的基因組DNA，利用特異性引物進行PCR擴增，所述特異性引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

擴增結束后，做出溶解曲線，獲得擴增動力學曲線；以標準品起始拷貝數的常用對數(lgC)為橫坐標，以循環數閾值(cycle threshold，Ct值)為縱坐標，推導出標準線性回歸方程(標準曲線)，獲得其敏感性試驗數據；以T-GyV3作為陽性標準質粒；設空白作為陰性對照；

(2)結果判定：

質控標準：陰性對照無Ct值并且無擴增曲線；陽性對照的Ct值應≤28.0，并出現特定的擴增曲線；如陰性對照和陽性條件不滿足以上條件，此次實驗視為無效；

結果描述及判定：無Ct值并且無擴增曲線，樣品判為陰性；Ct值≤36，且出現典型的擴增曲線，樣品判為陽性。

5.根據權利要求4所述的雞新型環狀病毒GyV3的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：所述PCR擴增的反應體系如下：反應液每管20μL，含有SYBR Green I Universal MasterMix10μL，10pmol/μL GyV3 forward、GyV3 reverse各1μL，RNase Free dH₂O6μL，待檢測的樣品DNA模板2μL。

6.根據權利要求4所述的雞新型環狀病毒GyV3的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：所述PCR擴增的反應條件為：95℃預變性60s；95℃10s，60℃10s，72℃10s，40個循環。