[發明專利]一種重組非洲豬瘟病毒pE120R亞單位可溶性蛋白及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201910732340.6
• 申請日: 2019-08-09
• 公開（公告）號: CN112341525A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 錢泓;吳有強;張強;徐玉蘭;吳素芳;車影
• 申請（專利權）人: 浙江海隆生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/01
• 分類號: C07K14/01;C12N15/34;C12N15/70;A61K39/12;A61P31/20;G01N33/569
• 代理公司: 北京乾誠五洲知識產權代理有限責任公司 11042
• 代理人: 付曉青;李廣文

本發明公開了一種重組的非洲豬瘟病毒結構蛋白pE120R亞單位可溶性蛋白及其制備方法和應用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述制備方法如下：1)將密碼子優化后的非洲豬瘟病毒pE120R蛋白如SEQ ID NO.1所示的編碼基因序列克隆到原核表達載體中，得到重組質粒；2)再將所述重組質粒轉化大腸桿菌感受態細胞中，得到重組表達的菌株；3)通過培養、篩選步驟2)中所述重組表達的菌株，得到高度表達的菌株；4)發酵培養步驟3)中所述高度表達的菌株，純化后，得到重組的非洲豬瘟病毒pE120R亞單位可溶性蛋白。本發明能夠提供一種可大規模工業化生產的非洲豬瘟結構蛋白pE120R亞單位可溶性蛋白且制備方法簡單、成本低，能夠達到國家現有標準。

技術領域

本發明屬于獸用生物制品技術領域。涉及一種重組非洲豬瘟病毒pE120R亞單位可溶性蛋白及其制備方法和應用。

背景技術

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV) 引起的豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病，發病率及死亡率高達100％。豬感染非洲豬瘟病毒后出現皮膚充血，內臟器官出血，高熱為特征臨床癥狀，豬是ASFV自然感染的唯一哺乳動物宿主，包括家豬和野豬，尤其是家豬，易感性極高，對畜牧業影響巨大。世界動物衛生組織將其列為A類疫病，我國也將其列為一類動物傳染病。

該病最早在1921年于非洲的肯尼亞國家確認發生，對非洲乃至全球多個國家的養豬業造成極大打擊。2018年8月份以來，在我國多個省份爆發，給我國養豬業帶來了嚴重的經濟損失。雖然，國內外學者對非洲豬瘟做了大量的研究工作，但研究發現：常規制備的非洲豬瘟滅活苗效果不明顯，而弱毒苗保護效果也不好，且安全性差，易造成散毒。目前，世界上尚未有有效預防非洲豬瘟的疫苗和治療該病的藥物發現，迫切需要新型疫苗和診斷試劑的研發和生產來預防和監控非洲豬瘟。

ASFV病毒是具有囊膜的蟲媒DNA病毒。病毒顆粒呈二十面體對稱結構，平均直徑200 nm，表面有含糖脂類的囊膜覆蓋。其病毒基因組為雙股線性DNA，大小為170-190kb，整個基因組大約有150個ORF，編碼150-200中蛋白質。pE120R蛋白又稱為p14.5由E120R 基因編碼的病毒結構蛋白。目前的研究表明，該蛋白主要定位于病毒粒子衣殼表面，主要影響病毒感染后病毒粒子的復制。也有研究發現該蛋白與主要p72蛋白相互作用并結合，共同組成衣殼，并參與翻譯后乙酰化修飾。體外試驗結果表明，pE120R是ASFV病毒的傳播的必需蛋白，且pE120R蛋白結構穩定。因此，pE120R對p72蛋白的研究非常關鍵，也有可能是一個很好的保護性抗原。在當前沒有可能大規模制備滅活疫苗或弱毒疫苗的情況下，確定一種制備結構穩定，免疫原性好的非洲豬瘟蛋白的方法，以便研究一種能夠預防該疾病的疫苗或開發非洲豬瘟相關診斷試劑具有重大的意義。

發明內容

為解決現有技術的上述技術問題，本發明提供一種非洲豬瘟pE120R亞單位可溶性蛋白的制備方法。

為實現上述目的，本發明采用以下的技術方案為：

一種非洲豬瘟pE120R亞單位可溶性蛋白，所述蛋白為非洲豬瘟pE120R蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

根據本發明的一個方面，本發明提供了一種可在大腸桿菌中表達pE120R蛋白的優化后的OPTI-pE120R的核苷酸序列。為了能夠在大腸桿菌中高效表達pE120R蛋白，本發明根據 GenBank:FR682468.1上已經存在公開的序列，我們對pE120R基因進行分析，首先對pE120R 基因編碼的密碼子的在原核表達中的密碼子偏好性進行了優化，其次對pE120R基因的GC 含量和mRNA在大腸桿菌的穩定性進行優化。所述最終優化后OPTI-pE120R的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。

用于編碼如上所述非洲豬瘟pE120R蛋白的基因，優選地，所述密碼子優化前的基因序列如SEQ ID NO.2所示。