[發明專利]利用Cas12a蛋白篩選雙等位基因突變細胞株的方法

在審

• 申請號: 201910731059.0
• 申請日: 2019-08-08
• 公開（公告）號: CN110438161A
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發明（設計）人: 張國良;肖國輝;劉淑燕;賀星;張蘇;歐敏
• 申請（專利權）人: 深圳市第三人民醫院
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N9/22;G01N21/64
• 代理公司: 深圳市深弘廣聯知識產權代理事務所(普通合伙) 44449
• 代理人: 向用秀

本發明涉及一種利用Cas12a蛋白篩選雙等位基因突變細胞株的方法，主要用于篩選基于CRISPR/Cas9編輯后的雙等位基因突變細胞株;解決雙等位基因突變細胞株難以篩選出的技術難題。本發明基于Cas12a蛋白（包括所有細菌來源）開發出的核酸檢測技術能夠簡單、高效、穩定地篩選CRISPR/Cas9編輯后的雙等位基因突變陽性細胞，此法且可以部分代替測序法，大大降低篩選的成本。

技術領域

本發明涉及醫學、生物領域，涉及一種利用Cas12a蛋白篩選基于CRISPR-Cas9系統基因編輯后的雙等位基因突變細胞株的方法。

背景技術

CRISPR/Cas9是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒以及外源性DNA。CRISPR/Cas9 系統通過將入侵外源DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相應的CRISPR RNAs(crRNAs)來指導同源序列的降解，從而提供免疫性。經過科學家的改造，CRISPR/Cas9被廣泛地應用于細菌、動植物，哺乳動物細胞的基因編輯。該方法構建的基因突變動物具有顯著高于傳統方法的生殖系轉移能力，是一種可靠、高效、快速的構建敲除動物模型的新方法，在生物、醫學領域表現出極大的潛力。此系統的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與tracrRNA (trans-activating RNA)結合形成tracrRNA/crRNA復合物，此復合物引導核酸酶Cas9蛋白再與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。而通過人工設計將tracrRNA/crRNA改造成具有引導作用的 SgRNA(single-guide RNA)，引導Cas9對DNA的定點切割。宿主細胞主要通過非同源末端修復(NHEJ)機制來修復Cas9編輯后的產生DNA切口，DNA斷裂處將會被插入錯誤DNA序列，導致基因的移碼突變，從而實現對靶基因的敲除。

目前用于CRISPR-Cas9系統基因編輯后的陽性細胞的初步篩選主要是T7E1核酸內切酶酶切分析，此酶識別并切割不完全配對DNA、十字型結構DNA、Holliday結構或交叉DNA、異源雙鏈DNA或者以更慢的速度切割或切刻雙鏈DNA。通過PCR反應擴增出帶有突變位點的DNA片段，然后與T7E1孵育，電泳檢測DNA切割情況來判斷基因敲除結果。此方法耗時耗力，結果不穩定，且無法區分單等位基因突變和雙等位基因敲除株，得通過后續的測序驗證，這就大大的增加的時間和金錢的成本。

發明內容

針對現有技術中存在的不足之處，本發明提供一種利用Cas12a 蛋白篩選基于CRISPR-Cas9系統基因編輯后的雙等位基因突變細胞株的方法。首先利用CRISPR-Cas9系統對基因進行編輯，在目標序列產生切口并且通過非同源末端修復產生插入突變堿基，造成靶基因的突變。通過PCR擴增富集靶基因針對目標序列設計gRNA，將Cas12a 蛋白與gRNA和靶基因，以及ssDNA(ssDNA-FQ)共孵育后，檢測熒光的強弱就可以篩選出CRISPR/Cas9編輯后的雙等位基因突變細胞株。

為實現上述目的，本發明提供一種利用Cas12a蛋白篩選雙等位基因突變細胞株的方法，其特征在于，包括以下步驟：

設計gRNA序列：根據CRISPR/Cas9的編輯位點的序列設計gRNA；

gRNA合成：運用T7轉綠酶體外合成；

引物設計：設計特異性引物擴增靶基因序列；

切割反應：gRNA引導Cas12a與靶基因結合，激活Cas12a的反式切割活性，從而切割熒光報告底物single strand DNA-FQ (ssDNA-FQ)，產生熒光；

熒光檢測：使用儀器檢測切割底物后的熒光，若檢測到強烈的熒光則為未突變株或者單等位基因突變株，若為檢測到熒光或者弱熒光則為雙等位基因突變細胞株。