[發明專利]利用Cas12a蛋白篩選雙等位基因突變細胞株的方法

在審

• 申請號: 201910731059.0
• 申請日: 2019-08-08
• 公開（公告）號: CN110438161A
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發明（設計）人: 張國良;肖國輝;劉淑燕;賀星;張蘇;歐敏
• 申請（專利權）人: 深圳市第三人民醫院
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N9/22;G01N21/64
• 代理公司: 深圳市深弘廣聯知識產權代理事務所(普通合伙) 44449
• 代理人: 向用秀

1.一種利用Cas12a蛋白篩選雙等位基因突變細胞株的方法，其特征在于，包括以下步驟：設計gRNA序列：根據CRISPR/Cas9的編輯位點的序列設計gRNA；

gRNA合成：運用T7轉綠酶體外合成；

引物設計：設計特異性引物擴增靶基因序列；

切割反應：gRNA引導Cas12a與靶基因結合，激活Cas12a的反式切割活性，從而切割熒光報告底物single strand DNA-FQ(ssDNA-FQ)，產生熒光；

熒光檢測：使用儀器檢測切割底物后的熒光，若檢測到強烈的熒光則為未突變株或者單等位基因突變株，若為檢測到熒光或者弱熒光則為雙等位基因突變細胞株。

2.根據權利要求1所述的利用Cas12a蛋白篩選雙等位基因突變細胞株的方法，其特征在于，在設計gRNA序列步驟中，根據CRISPR/Cas9的SgRNA靶向的目的基因位點序列設計gRNA，gRNA靶向的基因位點前需含有的PAM為TTTN或者TTN(N為任意A、T、G、C堿基)，gRNA長度為17～22nt，gRNA通過T7轉錄酶體外合成。

3.根據權利要求1所述的利用Cas12a蛋白篩選雙等位基因突變細胞株的方法，其特征在于，若gRNA針對的靶基因位點前沒有TTN，則可通過在PCR引物中引入TTTN或者TTN基序，使得gRNA針對的靶基因位點前含有Cas12a蛋白識別TTTN或者TTN基序。

4.根據權利要求1所述的利用Cas12a蛋白篩選雙等位基因突變細胞株的方法，其特征在于，將Cas12a+gRNA+target DNA+ssDNA-FQ于30-50℃孵育10-40分鐘，同時設置對照組進行實驗對比。

5.根據權利要求4所述的利用Cas12a蛋白篩選雙等位基因突變細胞株的方法，其特征在于，所述對照組共兩組，包括陰性對照組和陽性對照組，所述陰性對照組為：Cas12a+gRNA+ssDNA-FQ在37℃孵育30分鐘，所述陽性對照組為：Cas12a+gRNA+target DNA(未經CRISPR/Cas編輯的細胞的DNA)+ssDNA-FQ在37℃孵育30分鐘。

6.根據權利要求1所述的利用Cas12a蛋白篩選雙等位基因突變細胞株的方法，最后還需進行底物熒光檢測，從而確定是否成功進行篩選。