[發明專利]一種簡單便捷測定蛋白酶活力的方法

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• 申請號: 201910730740.3
• 申請日: 2019-08-08
• 公開（公告）號: CN110305934A
• 公開（公告）日: 2019-10-08
• 發明（設計）人: 路福平;劉逸寒;李玉;曹雪;李家霖;劉夫鋒;張會圖;王洪彬;彭沖
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;C07K5/103
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 郭曉迪

本發明提供一種簡便、快捷、高效測定蛋白酶活力的方法。該方法主要是利用一種寡肽化合物Suc?Ala?Ala?Pro?Tyr?pNA作為底物，配制該底物溶液與緩沖液、蛋白酶液組成的反應體系，蛋白酶水解該寡肽中酪氨酸(Tyr)與對硝基苯胺(pNA)之間的肽鍵，肽鍵斷裂后產生的pNA單體在OD₄₁₀處有吸收峰，反應后測定OD₄₁₀的吸光值，可得蛋白酶的酶活力。本發明過程操作簡單，耗時短，樣品需求量小，并且可以同時進行多個樣品的酶活測定工作，能夠滿足大批量樣品測定工作的需求。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種簡單便捷測定蛋白酶活力的方法

背景技術

在眾多的酶制劑中，蛋白酶因其在工業中的廣泛應用而占有很重要的地位。蛋白酶可以催化蛋白質大分子中的肽鍵，將其水解為氨基酸、肽、胨，所以也稱為肽酶。由于蛋白酶具有的水解作用，而被廣泛用于制革工業、洗滌劑、醫藥、食品和飼料加工等行業。在洗滌劑中使用枯草溶菌素的一種蛋白酶，大大提升了洗滌效果。

蛋白酶是生物行業最重要和最豐富的酶系之一，蛋白酶的來源較廣，廣泛分布在動物內臟、微生物和植物莖葉、果實中，其中細菌來源的蛋白酶占據全球市場近20％。從植物提取的蛋白酶主要是中性蛋白酶，其中具有代表性的是木瓜蛋白酶、角蛋白酶、菠蘿蛋白酶、和無花果蛋白酶。當前蛋白酶的來源包括植物來源，動物來源，微生物來源。其中，微生物來源的蛋白酶占據了全球蛋白酶銷售額的60％以上。

蛋白酶按照不同的分類方式分為不同的類型，有的以活性中心來分，或以作用的方式來分，也有的以最適pH來分，學術上都以活性中心來分。按活性中心可將蛋白酶分為以下四類：(1)絲氨酸蛋白酶，(2)半胱氨酸蛋白酶，(3)天門冬氨酸蛋白酶，(4)金屬蛋白酶。絲氨酸蛋白酶家族的成員廣泛存在于細菌、動物胰臟、霉菌中。絲氨酸蛋白酶以其專一性還可分為胰蛋白酶型、糜蛋白酶型、葡萄球菌型和粘細菌四種類型。絲氨酸蛋白酶的最適pH值在9.5-10.5是堿性蛋白酶，但有個別絲氨酸蛋白酶屬于中性蛋白酶。它們的活性部位都含Ser、 His、Asp，并且具有相同的催化機制。它們與底物結合部位的差異也決定了各自對底物的專一性。

蛋白酶水解肽鍵，產生氨基酸單體，國標法測定蛋白酶酶活力的原理是利用蛋白酶水解酪蛋白產生的酪氨酸上的酚基，能夠在堿性環境同福林酚反應產生藍色沉淀，這種藍色沉淀在OD₆₈₀有吸收峰的原理，測定蛋白酶水解底物中酪氨酸形成的肽鍵的能力。依據國標法測定蛋白酶活力的原理可知，國標法測定的酶活力指的是蛋白酶水解底物中酪氨酸產生的肽鍵的能力。國標法測定酶活的過程中，需要經過稀釋樣品，底物水解反應，終止反應，反應液離心取上清，福林酚顯色等步驟，單個樣品測定酶活所需時間較長且樣品需求量較大。國標中使用的底物干酪素是等電點為pH4.8的兩性蛋白質，在牛奶中以磷酸二鈣、磷酸三鈣或兩者的復合物形式存在，構造極為復雜，直到現在沒有完全確定的分子式，分子量大約為57000-375000。國標中的蛋白酶酶活單位是以單位時間消耗單位質量的干酪素定義的。

發明內容

本發明的目的在于針對現有國標測定方法的不足，提供一種簡便、快捷、高效測定蛋白酶活力的方法。該方法主要是利用一種寡肽化合物Suc-Ala-Ala-Pro-Tyr-pNA(縮寫：AAPY，分子結構式如下所示)作為底物，

合成該寡肽化合物，配制底物溶液與緩沖液、蛋白酶液組成的反應體系，蛋白酶水解該寡肽中酪氨酸(Tyr)與對硝基苯胺(pNA)之間的肽鍵，肽鍵斷裂后產生的pNA單體在OD₄₁₀處有吸收峰，水解反應后測定OD₄₁₀的吸光值，可得蛋白酶的酶活力。

進一步地，通過配制不同pH的緩沖液，該方法廣泛適用于測定酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶的酶活力。

進一步地，本發明的酶活測定方法主要包括如下步驟：