[發明專利]一種提高根瘤菌USDA110競爭結瘤能力的方法

有效

• 申請號: 201910730698.5
• 申請日: 2019-08-08
• 公開（公告）號: CN110452864B
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 李友國;胡倡;杜倩
• 申請（專利權）人: 華創佳農生物科技（武漢）有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12R1/01
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 馬超前

本發明公開了一種提高根瘤菌USDA110競爭結瘤能力的方法，通過pK19mob構建dgoK1單插入突變菌株USDA110(dgoKmut)，在土壤盆栽條件下，與接種USDA110的植物相比，接種USDA110(dgoKmut)使植物鮮重、瘤數、瘤重和酶活都有顯著性增加，與土著性根瘤菌相比，USDA110(dgoKmut)的競爭結瘤能力提高24.5％，可達31.8％。因此USDA110(dgoKmut)具有良好的共生固氮和競爭結瘤能力，可作為有潛力的優良菌株應用到田間試驗。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種提高根瘤菌USDA110競爭結瘤能力的方法。

背景技術

中國占世界耕地面積的8％-10％，但化肥的使用量卻占世界的35％。過量的化肥使用不僅增加了農民的經濟負擔，而且嚴重破壞了自然環境。我國主要糧食作物的化肥利用率只有20％-35％，而發達國家卻有40％-50％。同時，我國每年向自然環境排放2000多萬噸氮肥和1000多萬噸磷肥。過量使用氮肥已經造成了地表和地下水污染和土壤酸化，我們必須重視化肥過度使用造成的環境污染，采取措施以降低污染。通過豆科植物與根瘤菌固氮的方式，每年可提供3500萬噸氮，不僅能提高作物產量，還能減少化學氮肥的使用，從而減少環境污染，緩解土壤硬化。尤其在干旱地區，豆科植物是改善土壤理化性質的重要植物。因此，接種根瘤菌劑對提高大豆產量和減少環境污染具有重要作用。

美國、巴西和阿根廷等國家，根瘤菌劑的使用面積達35％-100％，而我國根瘤菌劑的使用面積還不到5％，這些數據表明，我國大豆產量和根瘤菌劑的施用量都遠遠落后于國外。其中很重要的一個原因是我國是大豆起源國，土壤中存在著許多土著根瘤菌，土壤中的土著根瘤菌競爭能力強但固氮能力弱，這降低了接種根瘤菌的占瘤率，從而使接種菌達不到預期效果。本發明通過基因工程手段構建競爭結瘤能力強的根瘤菌株以提高根瘤菌接種劑的接種效果。

發明內容

本發明的目的在于提高USDA110的競爭結瘤能力，通過本方法改造的根瘤菌株具有良好的固氮能力。

為了實現本發明的技術目的，本發明具體通過以下技術方案實現：

一種提高根瘤菌USDA110競爭結瘤能力的方法，通過將pK19mob質粒插入根瘤菌USDA110的dgoK1基因序列中，得到根瘤菌USDA110的突變體。

具體本發明包括以下步驟：

1)根據dgoK1基因序列，設計上下游引物，PCR擴增獲得目的片段；

2)將目的片段與載體pMD19-T連接，測序；

3)將測序正確的克隆抽質粒進行酶切回收，連接到pK19mob上；

4)將插入失活質粒轉化E.coli DH5α，抽質粒，進一步轉化到E.coli S17-1中，通過兩親本接合轉移導入野生菌株USDA110中。

進一步的，所述的上下游引物具體為：

F:CGGGATCC CCGCCTTGAAGCTTGCAA；

R:GGAATTCCAGGTCCTGGCCGAACG。

本發明的有益效果為：

1)USDA110為優良的大豆根瘤菌，但遺傳操作難，本發明通過快速突變的方法對其改造，從而獲得優良菌株；

2)能夠顯著提高根瘤菌的固氮能力和競爭結瘤能力，具有應用前景。

3)在土壤盆栽條件下，接種本發明突變后的根瘤菌使植物鮮重、瘤數、瘤重和酶活都有顯著性增加，與土著性根瘤菌相比，競爭結瘤能力提高24.8％，可達31.8％。因此突變后的根瘤菌具有良好的共生固氮和競爭結瘤能力，可作為有潛力的優良菌株應用到田間試驗。

附圖說明