[發明專利]一種檢測GP5基因5’端甲基化的試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201910729444.1
• 申請日: 2019-08-08
• 公開（公告）號: CN110257526B
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發明（設計）人: 楊光;張亮
• 申請（專利權）人: 天津康博爾生物基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12Q1/6804
• 代理公司: 天津市君硯知識產權代理有限公司 12239
• 代理人: 何德俊

本發明公開了一種檢測GP5基因5’端甲基化的試劑盒及其檢測方法，包括GP5基因5’端甲基化特異性擴增反應液和側向流核酸檢測試紙。基于PCR方法對GP5基因5’端甲基化進行識別與擴增，對擴增產物進行標記后，結合側向流技術，對GP5基因5’端甲基化進行檢測。本發明的有益效果是，采用簡單高效的DNA甲基化處理技術和PCR擴增技術，利用納米彩色乳膠微球作為核酸檢測的可視化信號，代替熒光探針等光學信號，無需復雜的操作和昂貴的儀器，實現比同類技術或產品更好的檢測靈敏性和特異性，實現快速、方便、靈敏、經濟地檢測GP5基因5’端甲基化，適合推廣應用和產業化。

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，特別是一種檢測GP5基因5’端甲基化的試劑盒及其檢測方法。

背景技術

乳腺癌(BC)是女性中最常見的惡性腫瘤，每年導致超過50萬人死亡。目前，隨著醫學的進步，特別是在I期和II期乳腺癌中，5年生存率相當可觀。但由于許多乳腺癌患者相對年輕。乳腺癌的高復發和轉移仍然是患者治愈路上的主要障礙。

近年來，很多研究表明，某些基因的DNA甲基化與乳腺癌的發展密切相關。基因組中異常的DNA甲基化可能通過沉默多種腫瘤抑制基因而促成惡性轉化。這種表觀遺傳改變被認為發生在腫瘤發展的早期，可能先于遺傳改變。其中，由倫敦大學學院于2018年領導的一項研究發現，乳腺癌樣本中名為EFC#93的DNA區域顯示異常的DNA甲基化模式。EFC#93區域位于GP5基因N端臨近信號肽的部分，即LRRNT區域，該區域異常的甲基化與轉移性乳腺癌有關。

該研究顯示，GP5基因5’端甲基化和CTC均為陽性的BC患者，其5年內復發率高于70％。因此，該研究認為血清中，GP5基因5’端甲基化異常可以作為轉移性乳腺癌患者的檢測指標，特異性可高達88％，最多可將診斷時間提前1年。

從血清中檢測游離DNA的甲基化異常，要求檢測方法具有極高的靈敏度和特異性。目前常見的方法有MSP、Methylight和Heavymethyl。其中MSP是最常見的方法，但容易出現假陽性。而Methylight和Heavymethyl均是基于熒光PCR，需要昂貴的儀器和復雜的操作、分析流程。

發明內容

本發明旨在一定程度上解決上述相關技術中的技術問題之一。因此，本發明的目的在于提出一種檢測GP5基因5’端甲基化的試劑盒及其檢測方法，可用于體外定性檢測轉移性乳腺癌患者血清、血漿中GP5基因5’端的甲基化，采用簡單高效的DNA甲基化處理技術和PCR擴增技術，利用納米彩色乳膠微球作為核酸檢測的可視化信號，代替熒光探針等光學信號，無需復雜的操作和昂貴的儀器，實現比同類技術或產品更好的檢測靈敏性和特異性，實現快速、方便、靈敏、經濟地檢測GP5基因5’端甲基化，適合推廣應用和產業化。

為解決上述問題，本發明采用的技術方案是：

第一方面，本發明提供一種檢測GP5基因5’端甲基化的試劑盒，包括人GP5基因5’端甲基化特異性擴增反應液和側向流核酸檢測試紙；所述GP5基因5’端甲基化特異性擴增反應液包括甲基化DNA處理組分、GP5基因5’端甲基化特異性引物組、熱穩定性DNA聚合酶、UNG酶和反應緩沖液，所述側向流核酸檢測試紙包括樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜檢測區和吸水墊。

所述甲基化DNA處理組分為亞硫酸鹽溶液或甲基化依賴性的限制內切酶；所述亞硫酸鹽溶液包括3-5M亞硫酸氫鈉、5％-10％乙二醇二甲醚和5-10mM氫醌；所述甲基化依賴性的限制內切酶為MteI、LpnPI、BlsI、GlaI、PcsI、KroI中的一種或幾種。