[發明專利]hMSC生產試劑盒開發和質量管理標準優化和體系建立

在審

• 申請號: 201910727195.2
• 申請日: 2019-08-07
• 公開（公告）號: CN112342191A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 路春光
• 申請（專利權）人: 路春光
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;G01N33/569
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種優化的從胎兒附屬物（臍血、臍帶、胎盤等）、毛囊、脂肪和牙髓等中分離間充質干細胞（MSC）；人間充質干細胞（hMSC）工業化生產體系和質量管理體系優化和標準建立，MSC擴增培養試劑盒和鑒定試劑盒及應用：

（1）產婦臍帶捐獻準入標準：

無家族性遺傳病及病原微生物感染，知曉并簽署知情同意書；

運輸過程：臍帶采集管完全密封，運輸溫度為4℃-25℃；運輸時間不應超過24h；

傳染病檢測：母血或臍血TP /HIV/HBV/HCV/HCMV/EBV/HPV/HHV陰性；儲運液取樣細菌培養無菌、支原體檢測陰性；

母血無凝塊、溶血及重度乳糜，儲存容器無破損；無母血臍帶中可留少量臍血；

臍帶標準：重量≥15g，形態飽滿呈乳白色；

（2）P2種子細胞庫控制

培養液澄清，細胞長梭形渦旋狀排列，細胞融合度達80%，P2代種子細胞入種子細胞庫前取500ul做內毒素檢測，10⁶-10⁷細胞做流式檢測，上清和細胞懸液留樣，留樣樣本按照編碼規格進行編號；

（3）P5工作細胞庫控制

種子細胞復蘇，傳代培養，待培養至P5代細胞長到80-90%融合時，收獲細胞，即為工作細胞庫，細胞長梭形渦旋狀排列，細胞融合度達80%，細胞數量≥1×10⁹，細胞活率≥90%，P5代工作細胞收獲時各取1ml做內毒素檢測、真菌和細胞內外病毒因子檢測，第二次離心后取20ml上清做菌檢、 BSA殘留量檢測、抗生素殘留量檢測、EGF、bFGF殘留量和支原體檢測，P5代細胞入工作細胞庫待檢區，上清和細胞懸液留樣各四份，留樣樣本按照編碼規格編號；

（4）凍存裝置：完全密封，細胞編號、類型、凍存日期標記完整清晰，保存位置明確；凍存過程：程序降溫；

（5） 復蘇過程：37℃快速復蘇；

（6） MSC細胞制劑出庫控制標準：

細胞數量達標，細胞活率≥90%，內毒素檢測陰性；取適量細胞用適量生理鹽水懸浮，添加人血白蛋白濃度至3%，經細胞篩過濾；

采用生理鹽水袋或專用容器灌裝，終體積可根據要求適當選擇（5～80）ml，細胞制劑進行細胞數量、活率、內毒素檢測，細胞制劑留樣4份，留樣樣本按照編碼規則編號；

質保部人員負責做好對細胞制劑出庫的審核與質量監督，

細胞制劑接收人即為細胞制劑運輸人，負責再次確認、接收出庫細胞制劑，并放置進保溫血箱，保證細胞制劑安全存放（4～25℃），避光保存和運輸，直至運達目的地，自生產之時起，有效期為12小時；

（2）hMSC培養試劑盒，包括容器和裝入容器中的臨床用MSC細胞擴增培養液MSC-、細胞培養添加劑MSC-，本發明提供一種臨床用MSC細胞擴增基礎培養液MSC- ，PH7.2～7.4，平衡鹽Earle’s 鹽 、核苷、L-谷氨酰胺2mM、NaHCO3 2200mg/L、D-葡萄糖 1000mg/L、丙酮酸鈉 1mM、酚紅指示10mg/L、無機鹽、氨基酸、維生素、核糖核苷、脫氧核糖核苷等，使用時添加2mM GlutaMAX?-I和10%Prime FBS，本發明不排除可以采用上述培養基之外的培養基實施培養；

本發明提供一種MSC細胞培養添加劑MSC-，其中含有2-50ng/mL bFGF、2-50ng/ml EGF；

優選的[0012]中，3-20ng/mL bFGF、3-20ng/ml EGF；

MSC按照細胞密度8-10×10³/cm²用完全培養液重懸；

所述完全培養液的配制：MSC- 中添加1/1000 MSC-、2mM GlutaMAX?-I和10%Prime FBS；

（3）一種hMSC鑒定試劑盒，所述臨床用MSC細胞流式表型和活性鑒定試劑盒包括五組雙色抗體組合物，分別是IgG-Percp-cy5/CD105-PE/CD73/CD90、CD44-PE和Annexin-FINKTC/PI，洗滌液50ml一管，固定液50ml一管；每5-10ul可檢測一次，共計50套，所述洗滌液是磷酸鹽緩沖液；所述固定液是1%多聚甲醛；

（4）本發明還包括將上述hMSC培養試劑，MSC細胞擴增培養液MSC- 、細胞培養添加劑MSC-和鑒定試劑裝入專用潔凈容器制備成試劑盒。