[發明專利]一種高分辨率熔解曲線鑒定耳念珠菌的方法

在審

• 申請號: 201910726815.0
• 申請日: 2019-08-07
• 公開（公告）號: CN110408720A
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發明（設計）人: 肖盟;龔杰;黃晶晶;范欣;徐英春;張建中
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院北京協和醫院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 北京馳納智財知識產權代理事務所(普通合伙) 11367
• 代理人: 李佳佳

本發明提供一種高分辨率熔解曲線鑒定耳念珠菌的方法，包括如下步驟：步驟一、準備待鑒定菌株包括耳念菌株和對照菌株的DNA模板；步驟二、設計上下游引物；步驟三、利用高分辨率溶解曲線技術HRM，獲取各菌株高分辨溶解曲線圖，具體為利用Real?time PCR技術，通過實時檢測DNA熔解過程中熒光信號值的變化獲取各菌株高分辨溶解曲線圖；步驟四、利用分析軟件分析鑒定待鑒定菌株的具體類型；步驟五、測定步驟三中結果為陽性菌株的核苷酸序列；步驟六、驗證鑒定方法的靈敏度。本發明提供高分辨率熔解曲線鑒定耳念珠菌的方法，可以明確鑒定耳念珠菌并與相近的菌株進行區分，方法操作簡單，準確高效。

技術領域

本發明涉及菌種鑒定領域，特別涉及一種高分辨率熔解曲線鑒定耳念珠菌的方法。

背景技術

耳念珠菌是新發多重耐藥真菌，于2009年首次報道于日本，美國首例耳念珠菌報道于2013年。但自2016年以來，美國監測發現耳念珠菌在紐約、新澤西、芝加哥等地發生率快速升高，并出現大量院感暴發案例。其次，在美國發現的耳念珠菌，除對經典抗真菌藥物——氟康唑高度耐藥以外，50％以上的菌株對伏立康唑耐藥，約1/3的菌株對兩性霉素B耐藥。其中特別是對兩性霉素B耐藥，在臨床常見的念珠菌菌種中十分少見，使得該菌更受關注。隨后在英國、印度等多個國家地區發現了高度耐藥耳念珠菌，以及耳念珠菌引起院感暴發的案例，使該種病原獲得了全球的關注。美國疾病控制與預防中心已將耳念珠菌列入“緊急威脅”名單。在耳念珠菌引起的真菌血癥中，30天死亡率達39％、90天死亡率達58％。我國首例耳念珠菌感染于2018年6月在北京報道，截止目前我國共報道耳念珠菌感染18例。對耳念珠菌的準確鑒定對臨床診斷、治療和感染控制十分重要。

然而，傳統臨床實驗室鑒定方法無法將其準確鑒定，或可能發生錯誤鑒定。使用聚合酶鏈式反應(PCR)對菌種核糖體DNA轉錄間區進行擴增及核酸序列測定是物種鑒定的“金標準”，但操作復雜、耗時較長。

發明內容

為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種用于非診斷和治療目的高分辨率熔解曲線鑒定耳念珠菌的方法，可以明確鑒定耳念珠菌并與相近菌株的進行區分，方法操作簡單，準確高效。

一種高分辨率熔解曲線鑒定耳念珠菌的方法，包括如下步驟：

步驟一、準備待鑒定菌株包括耳念珠菌和對照菌株的DNA模板；

步驟二、設計上下游引物；

步驟三、利用高分辨率溶解曲線技術HRM，獲取各菌株高分辨溶解曲線圖，具體為利用Real-time PCR技術，通過實時檢測DNA熔解過程中熒光信號值的變化獲取各菌株高分辨溶解曲線圖；

步驟四、利用分析軟件分析鑒定待鑒定菌株的具體類型；

步驟五、測定步驟三中結果為陽性菌株的核苷酸序列；

步驟六、驗證鑒定方法的靈敏度。

高分辨溶解曲線技術HRM的基本原理：雙鏈核苷酸(double strand DNA，dsDNA)的熱穩定性受其長度和堿基組成的影響，序列變化會導致升溫過程中dsDNA解鏈行為的改變。因為所用的熒光染料只能嵌入并結合到dsDNA上，因此利用實時PCR技術，通過實時檢測dsDNA熔解過程中熒光信號值的變化，就能以生成不同形狀熔解曲線的方式將PCR產物中存在的差異直觀地展示出來。同時，借助于專業性的分析軟件就可以對測試群體實現基于不同形狀熔解曲線的基因分型或歸類。

優選的是，步驟一中對照菌株為近似同源物種希木龍念珠菌菌種復合體中各物種及變種，包括：Candida haemulonii-希木龍念珠菌，Candida haemulonii var.vulnera-希木龍念珠菌vulnera變種，Candida duobushaemulonii-偽希木龍念珠菌，Candidapseudohaemulonii-假希木龍念珠菌；