[發明專利]一種高分辨率熔解曲線鑒定耳念珠菌的方法

在審

• 申請號: 201910726815.0
• 申請日: 2019-08-07
• 公開（公告）號: CN110408720A
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發明（設計）人: 肖盟;龔杰;黃晶晶;范欣;徐英春;張建中
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院北京協和醫院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 北京馳納智財知識產權代理事務所(普通合伙) 11367
• 代理人: 李佳佳

1.一種高分辨率熔解曲線鑒定耳念珠菌的方法，包括如下步驟：

步驟一、準備待鑒定菌株包括耳念菌株和對照菌株的DNA模板；

步驟二、設計上下游引物；

步驟三、利用高分辨率溶解曲線技術HRM，獲取各菌株高分辨溶解曲線圖，具體為利用Real-time PCR技術，通過實時檢測DNA熔解過程中熒光信號值的變化獲取各菌株高分辨溶解曲線圖；

步驟四、利用分析軟件分析鑒定待鑒定菌株的具體類型；

步驟五、測定步驟三中結果為陽性菌株的核苷酸序列；

步驟六、驗證鑒定方法的靈敏度。

2.如權利要求1所述的高分辨率熔解曲線鑒定耳念珠菌的方法，其特征在于，步驟一中對照菌株為近似同源物種希木龍念珠菌菌種復合體中各物種及變種，包括：Candidahaemulonii-希木龍念珠菌，Candida haemulonii var.vulnera-希木龍念珠菌vulnera變種，Candida duobushaemulonii-偽希木龍念珠菌，Candida pseudohaemulonii-假希木龍念珠菌；

其他念珠菌物種：Candida krusei-克柔念珠菌，Candida tropicalis-熱帶念珠菌，Candida albicans-白念珠菌，Candida nivariensis-尼瓦利亞念珠菌，Candidabracarensis-布加拉念珠菌，Candida glabrata-光滑念珠菌，Candida metapsilosis-似平滑念珠菌，Candida orthopsilosis-擬平滑念珠菌，Candida parapsilosis-近平滑念珠菌；

其他真菌物種：Aspergillus sydowii-聚多曲霉，Aspergillus flavus-黃曲霉，Alternaria alternate-鏈格孢菌，Cladosporium sphaerospermum-球孢枝孢菌，Curvularia lunata-月狀彎孢菌，Fusarium solani-茄病鐮刀菌，Hortaea werneckii-威尼克外瓶霉，Kodamaea ohmeri-奧默柯達菌，Talaromyces funiculosus-繩狀籃狀菌，Trichophyton rubrum-紅色毛癬菌；

對照菌株選取上述菌中的部分菌株或全部菌株。

3.如權利要求2所述的高分辨率熔解曲線鑒定耳念珠菌的方法，其特征在于，步驟二中

上游引物為5'-CGTAGTATGACTTGCAGACG-3'，

下游引物為5'-GCGGGTAGTCCTACCTGAT-3'。

4.如權利要求3所述的高分辨率熔解曲線鑒定耳念珠菌的方法，其特征在于，步驟二中上下游引物使用Primer3引物設計軟件進行設計，產物長度為200bp。

5.如權利要求4所述的高分辨率熔解曲線鑒定耳念珠菌的方法，其特征在于，步驟三中Real-time PCR反應體系包括2×Taqman qPCR Mix(Takara)15μL、上，下游引物各0.9μL、Rox Reference DyeⅡ(100×)0.3μL、Evagreen，20×in Water 1.5μL、DNA模板2μL，用滅菌純水補足體系至30μL。

6.如權利要求5所述的高分辨率熔解曲線鑒定耳念珠菌的方法，其特征在于，步驟三中Real-time PCR反應條件為預變性：95℃10min；95℃15s，62℃40s，35個循環，升降溫速度1.6℃/s。

7.如權利要求6所述的高分辨率熔解曲線鑒定耳念珠菌的方法，其特征在于，步驟三中高分辨溶解曲線技術HRM程序為：95℃10s，60℃1min，(0.025℃/s升溫至)95℃15s，60℃15s，以1.6℃/s速率升降溫，連續檢測熒光強度。

8.如權利要求7所述的高分辨率熔解曲線鑒定耳念珠菌的方法，其特征在于，步驟四中利用high-resolution melting analysis軟件進行結果分析。