[發明專利]一種水曲柳嫩綠半致密型愈傷組織誘導不定芽再生的方法

有效

• 申請號: 201910725313.6
• 申請日: 2019-08-07
• 公開（公告）號: CN111758566B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 詹亞光;于磊;李新宇
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種通過誘導嫩綠半致密愈傷組織這個關鍵環節，從而實現下水曲柳下胚軸和莖段經愈傷組織途徑的不定芽再生與繁殖的方法。從成熟胚培養至子葉展開(21d)時，切取下胚軸，接種于a20培養基中；從無菌苗切取莖段，接種于c12培養基中，經暗/光交替培養，獲得嫩綠色半致密型愈傷組織，下胚軸和莖段愈傷組織誘導率分別為88.69％和99.15％，不定芽在愈傷組織塊半致密縫隙處形成，誘導率分別為10.52％和33.33％。本發明解決了水曲柳經愈傷組織途徑難以分化不定芽瓶頸環節，通過高效的愈傷組織誘導及有效的不定芽再生，為水曲柳快速繁殖技術奠定了堅實的基礎。

技術領域：

本發明屬于林木遺傳育種領域，植物組織培養范疇，水曲柳高效繁殖技術

背景技術：

水曲柳種子具有生長間隔期長、深休眠、繁殖速度慢等特性，優良無性系及雜交優勢種需20年左右才能進入成熟期，扦插嫁接無性繁殖技術受季節等因素限制，無法將優良子代大量擴繁，因此建立一個高效的繁殖技術尤為重要。2001年張慧君等對水曲柳芽、莖尖、種子等外植體誘導出苗培養進行了初步探索；2010年沈海龍等根據下胚軸嘗試建立繁殖系統，但繁殖系數低且不穩定；2013年丁小萌等以水曲柳葉柄為外植體誘導得到水曲柳疏松愈傷組織；2018年梁雪等建立了水曲柳懸浮培養體系；水曲柳愈傷組織較容易通過誘導外植體獲得，但是愈傷組織進行不定芽誘導分化技術的研究目前尚不成熟。本發明建立并優化一個高效的愈傷組織誘導與不定芽再生體系。

發明內容：

本發明提供了一種高效的愈傷組織誘導與不定芽再生的方法，具體內容包括：

1，通過四種水曲柳外植體(下胚軸、根、子葉、莖段)分別誘導愈傷組織和不定芽的再生，篩選得出水曲柳組培苗莖段為誘導愈傷組織及不定芽的最適外植體；

2，通過對比三種不同的培養基(WPM、MS、MSB5)對不定芽誘導率的影響，最終選出MSB5最佳培養基；培養條件：外植體經暗培養14d后轉光培養(光照強度80μmol*m^-2*s^-1、光16h/暗8h、溫度25±2℃、濕度80％-90％)20d時可誘導出嫩綠半致密型愈傷組織，30d誘導出叢生不定芽。

3，通過外源添加兩種激素(6-BA、TDZ)的多種組合試驗，觀察并統計存活率，愈傷組織及不定芽誘導率，綜合得出：下胚軸在a20(MS+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂+5mg/L 6-BA+1mg/L TDZ)培養基、莖段在c12(MSB5+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂+5mg/L 6-BA+8mg/L TDZ+0.1mg/LIBA+2mg/L甘氨酸+5％椰子水pH均為5.8)培養基上愈傷組織誘導率分別為88.69％和99.15％，不定芽誘導率分別為10.5％和33.33％。

本發明是水曲柳組培苗快速繁殖的關鍵技術之一，通過高效的愈傷組織誘導及有效的不定芽再生，填補了水曲柳無性繁殖領域中組培苗快速繁殖的研究空白，解決了水曲柳經愈傷組織途徑難以分化不定芽的瓶頸環節，通過高效的愈傷組織誘導及有效的不定芽再生，為水曲柳快速繁殖技術奠定了堅實的基礎。

附圖說明：

圖1下胚軸、根和子葉誘導愈傷組織及下胚軸再生不定芽

圖2莖段誘導愈傷組織及其再生不定芽

具體實施方式：

1，水曲柳種子消毒及接種的具體步驟

將春化處理后的水曲柳種子剝去外種皮，流水沖洗24h后，于超凈工作臺內，經70％酒精處理30-45s，10％NaClO消毒15-20min，無菌水沖洗4次，剝出胚，接入含有30g/L蔗糖，7g/L瓊脂的WPM培養基中培養。

2，水曲柳組培苗不同外植體的不定芽誘導培養基